Molekuláris klónozás polimeráz láncreakcióval, oktatási útmutató a sejtmérnökség számára

A megfelelő restrikciós enzimek kiválasztása meghatározott kritériumok alapján

Egy tömör példával élve, a tdTomato fluoreszcens fehérjét klónoztuk egy alfaretrovirális vektorba. Ezt követően egy tdTomato-t expresszáló egér leukémiás sejtvonalat hoztak létre. Ezt a sejtvonalat a preklinikai immunterápiás vizsgálatokban a tumorsejtek egerekbe történő befecskendezése után a tumorsejtek nyomon követésére fogják használni. Ez a klónozási módszer azonban bármely más génre is alkalmazható. A klónozási projekt megkezdéséhez elemezni kell az érdeklődésre számot tartó gént (GOI). Először is ellenőrizzük, hogy az általunk annotált szekvencia tartalmaz-e startkódont (ATG, a leggyakoribb startkódon) és a három stopkódon (TAA, TAG, TGA) egyikét. Abban az esetben, ha a gént korábban manipulálták vagy egy másik génhez fuzionálták (pl. egy 2A szekvencián keresztül), előfordulhat, hogy az érdeklődésre számot tartó génnek nincs stop kodonja. Ilyen esetekben a megjegyzett szekvencia végére egy stop kodont kell beilleszteni. Azt is hasznos megvizsgálni, hogy a GOI tartalmaz-e nyitott olvasási keretet (ORF). Ez azért fontos, mert a szekvenciák gyakori manipulálása akár szoftverrel, akár klónozással tévesen nukleotidokat adhat hozzá vagy törölhet. Mi a Clone Manager szoftvert (SciEd) használjuk az ORF-ek keresésére a plazmidszekvenciáinkban; azonban számos ingyenes weboldal használható az ORF-ek keresésére, köztük az NCBI open reading frame finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html).

A tdTomato gén ATG startkódont és TAA stopkódont tartalmaz (1. ábra). A tdTomato gén mérete 716 bp.

Áttekintés az érdekes gén kezdetéről és végéről. (A) A tdTomato gén kezdetének és végének nukleotidszekvenciái láthatóak. A kódoló szál nukleotidjai félkövérrel vannak jelölve (B) A megfelelő restrikciós enzimhelyeket és a Kozak-szekvenciát tartalmazó forward és reverse primerek nukleotidszekvenciái láthatóak.

A következő lépésben a GOI amplifikációjához megfelelő restrikciós enzimhelyeket tartalmazó PCR-primereket kell tervezni. Az optimális restrikciós enzimek kiválasztásához több kritériumot kell figyelembe venni. Először is, a restrikciós enzimek kötőhelyeinek ideális esetben a vektoron belüli többszörös klónozási helyen kell rendelkezésre állniuk. Alternatívaként a vektor szekvenciájában a promóter után helyezkedhetnek el. A restrikciós enzimeknek egyszeres vágóknak kell lenniük (az egyszeres vágók csak egy restrikciós helyet céloznak meg a DNS-szekvencián belül) (2A. ábra). Ha kettős vagy többszörös vágók, akkor olyan szekvencián belül kell vágniuk, amely nem szükséges a vektorplazmid megfelelő működéséhez, és végül eltávolítják őket (2B. ábra). Az is lehetséges, hogy egy dupla vágó vagy többszörös vágó enzimet választunk, amelyek a promóter után vágják a vektort, és szintén nem a plazmid létfontosságú szekvenciáján belül (2C. ábra). A kettős vágó vagy többszörös vágó enzimeknek két vagy több restrikciós helyük van egy DNS-szekvencián. A vektor dupla vagy többszörös vágóval történő vágása két azonos véget eredményezne. Ilyen esetben az insert kazettának is azonos restrikciós enzimhelyeket kell tartalmaznia mindkét végén. Ezért amikor az inzert és a vektor fragmentumokat ligációs kísérletben összekeverjük, az inzert vagy a helyes orientációban (a startkódontól a stopkódonig) vagy fordítva (a stopkódontól a startkódonig) fuzionálhat a vektorral. Egy harmadik forgatókönyv is előfordulhat, ha a vektorfragment egy önligáló kört alkot, amelyből az inszert egyáltalán kimarad. Miután a DNS-t restrikciós enzimekkel inkubáltuk, a vektorplazmid 5′ és 3′ végének defoszforilálása alkalikus foszfatáz enzimmel nagymértékben csökkenti az önligálódás kockázatát. Ezért fontos, hogy a fragmentumok ligálása után a klónozási terméket e három termékre (helyes orientáció, fordított orientáció, önligálás) szűrjük.

A megfelelő restrikciós enzimek kiválasztása a PCR-klónozáshoz meghatározott kritériumok alapján. (A) Két egyvágó restrikciós enzim (E1 és E2) található a promóter után. (B) Az E1 és E2 restrikciós enzimek többször (itt enzimenként kétszer) vágják a plazmidot a promótertől lefelé. (C) Az E1 restrikciós enzim többször is elvágja a promóter utáni plazmidot. (D) A tdTomato gént és a restrikciós enzimhelyeket tartalmazó PCR-terméket gélen futtattuk, mielőtt extraháltuk volna a downstream alkalmazásokhoz.

Másrészt, a ragadós végű DNS-töredékek nagyobb hatékonysága miatt kívánatos, hogy a restrikciós enzimek közül legalább az egyik (jobb esetben mindkét) úgynevezett ragadós végű vágóenzim legyen. A ragadós végű vágók aszimmetrikusan hasítják a DNS-t, komplementer összetartozó végeket létrehozva. Ezzel szemben a tompa végű vágók szimmetrikusan vágják a szekvenciát, nem hagyva túlnyúlásokat. A tompa végű fragmentumok klónozása nehezebb. Mindazonáltal a nagyobb inzert/vektor mólarány (5 vagy több) és a 10% polietilénglikol (PEG) használata javíthatja a tompa végű fragmentumok ligálását.

Harmadszor, egyes restrikciós enzimek nem vágják a metilált DNS-t. A legtöbb E. coli törzs Dam vagy Dcm metilázokat tartalmaz, amelyek metilálják a DNS-szekvenciákat. Ezáltal ellenállóvá válnak a metilációra érzékeny restrikciós enzimekkel szemben. Mivel a vektor-DNS-t többnyire E. coliban állítják elő, az metilált lesz. Ezért kívánatos a metiláció-érzékeny restrikciós enzimek elkerülése; néha azonban egy metiláció-érzékeny restrikciós enzim izoszkizomerje rezisztens a metilációval szemben. Például az Acc65I enzim érzékeny, míg izoszkizomerje, a kpnI rezisztens a metilációval szemben. Az izoszkizomerek olyan restrikciós enzimek, amelyek ugyanazokat a nukleotidszekvenciákat ismerik fel. Ha nem marad más lehetőség, mint a metilációra érzékeny restrikciós enzimek használata, akkor a vektor DNS-t dam – dcm – E. coli törzsekben kell előállítani. E törzsek, valamint a molekuláris klónozáshoz használt gyakori E. coli gazdatörzsek listáját az 1. táblázat foglalja össze. A restrikciós enzimek metilációs érzékenységére vonatkozó információkat általában a gyártó adja meg.

Negyedszer megkönnyíti a klónozást, ha a restrikciós enzimek teljes működéséhez szükséges puffer azonos, mert így kettős restrikciós emésztést lehet végezni. Ez időt takarít meg, és csökkenti a DNS-veszteséget a tisztítás során. Előfordulhat, hogy az egyik restrikciós enzim egy pufferben aktív, a másik enzim pedig ugyanannak a puffernek a kétszeres koncentrációjában. Például a Thermo Scientific NheI enzimje a Tango 1X pufferben (Thermo Scientific), az EcoR1 enzim pedig a Tango 2X pufferben (Thermo Scientific) aktív. Ilyen esetekben a plazmid DNS-t először a magasabb pufferkoncentrációt igénylő enzimmel (itt EcoR1) kell emészteni. Ezt követi a következő (alacsonyabb koncentrációt igénylő (itt NheI)) enzim pufferének hígítása ugyanabban a pufferben. Az univerzális pufferek megjelenése azonban leegyszerűsítette a DNS-szekvenciák kettős emésztését. Példánkban a vektor AgeI és SalI restrikciós helyeket tartalmaz. Ezeket az enzimhelyeket használtuk fel a PCR-primerek tervezéséhez (1. ábra). A megfelelő restrikciós enzimes emésztéshez elengedhetetlen, hogy a plazmid tisztasága magas legyen. A tisztítás utáni tisztaság meghatározására a spektrofotométerrel mért DNS-abszorbancia használható. A DNS, a fehérjék és az oldószerek 260 nm-en, 280 nm-en, illetve 230 nm-en abszorbeálnak. A DNS-minták esetében a >1,8 OD 260/280 arány és a 2 és 2,2 közötti OD 260/230 arány tekinthető tisztának. A mi példaértékű plazmidkészítményeink OD 260/280 és 260/230 aránya 1,89, illetve 2,22 volt. Megfigyeltük, hogy a gélen extrahált vektor és inzert DNS fragmentumok tisztasága a restrikciós emésztés után alacsonyabb volt; a ligálás ilyen esetekben is működik, azonban a nagy tisztaságú fragmentumok használatával jobb eredmények várhatók.

A különböző vektorok (vírusos expresszió és csomagolás, üres gerincek, fluoreszcens fehérjék, indukálható vektorok, epitópcímkék, fúziós fehérjék, riporter gének, fajspecifikus expressziós rendszerek, szelekciós markerek, promóterek, shRNS expresszió és genom engineering) kiválasztásához hasznos lehet az alábbi plazmidtár weboldal:http://www.addgene.org/browse/.

E. coli klónozási vektorok gyűjteménye a következő weboldalon érhető el:http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/cvector/cvectorExplanation.jsp.

Klónozási primerek tervezése meghatározott kritériumok alapján

A PCR primerek tervezéséhez ellenőrizze az indító- és stoppkódonokat az irányított indikátorban. Keresse meg a kívánt restrikciós enzimek szekvenciáját (elérhető a gyártók weboldalain) a forward primerhez (3A. ábra). Ennek az irányított indikátor előtt kell elhelyezkednie (1B. ábra). Az úgynevezett Kozak-szekvencia megtalálható az eukarióta mRNS-ekben, és javítja a transzláció megindulását. A Kozak-szekvencia (GCCACC) hozzáadása az ATG startkódon előtt előnyös, mivel eukariótákban növeli a transzlációt és a kívánt fehérje expresszióját. Ezért a GCCACC-ot közvetlenül az AgeI restrikciós enzimszekvencia után és az ATG startkódon előtt illesztettük be. Ezután az ATG startkódontól kezdődően a GOI első 18-30 nukleotidját hozzáadtuk a forward primer szekvenciához. Ezek az átfedő nukleotidok, amelyek a sablon DNS-hez kötődnek, határozzák meg a lágyulási hőmérsékletet (Tm). Ez utóbbi általában 60 °C-nál magasabb. Itt a Phusion nagy hűségű DNS-polimerázt (Thermo Scientific) használjuk. Az optimális Tm meghatározásához a következő weboldalakat használhatja:http://www.thermoscientificbio.com/webtools/tmc/.

Primerek tervezése meghatározott kritériumok alapján PCR-klónozáshoz. (A-B) Az előremenő és a fordított primer szekvenciái ábrázolva. A kódoló szál végét át kell alakítani a fordított komplement formátumba a fordított primer tervezéséhez. További információért lásd a szöveget.

https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/tm-calculator.

A forward primerünk Tm értéke 66°C.

A fordított primer tervezéséhez válasszuk ki a GOI utolsó 18-30 nukleotidját, beleértve a stop kodont is (3B ábra). Ezután számítsa ki ennek a szekvenciának a Tm-jét, amelynek 60°C felett kell lennie, és közel kell lennie az elülső primer Tm-jéhez. A fordított primerünk átfedő szekvenciájának Tm-je 68°C volt. Ezután adjuk hozzá a második restrikciós enzimhely (ebben az esetben SalI) célszekvenciáját közvetlenül a stop kodon után. Végül alakítsuk át ezt az összeállított szekvenciát reverz-komplement szekvenciává. A fordított primer szekvenciájának meghatározásához a következő weboldalakat használhatjuk:

http://reverse-complement.com/

http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.htmlThis azért fontos, mert a fordított primer a kódoló szálhoz kötődik, ezért szekvenciájának (5′ → 3′) fordítottan komplementernek kell lennie a kódoló szál szekvenciájával (1A. ábra).

PCR végrehajtása korrektor polimerázok használatával

Mivel a PCR-reakció a célszekvencia logaritmikus amplifikációját követi, minden replikációs hiba e folyamat során amplifikálódik. A nem proofreading DNS-polimerázok, például a Taq-polimeráz hibaaránya körülbelül 8 × 10-6 hiba/bp/PCR-ciklus; a proofreading enzimek, például a Phusion-polimeráz hibaaránya azonban 4,4 × 10-7 hiba/bp/PCR-ciklus. Kiváló hűsége és feldolgozhatósága miatt ebben a példában a Phusion DNS-polimerázt használtuk. Meg kell jegyezni, hogy a Phusion más hőmérsékleti követelményeket támaszt, mint más DNS-polimerázok. A Phusion primer Tm-jét a Breslauer-módszer alapján számították ki, és magasabb, mint a Taq vagy a pfu polimerázok használatával kapott Tm. Az optimális eredmények elérése érdekében a Tm-t az enzimszolgáltatók weboldalán található információk alapján kell kiszámítani. Továbbá a Phusion nagyobb sebessége miatt általában 15-30 másodperc elegendő az érdeklődésre számot tartó szekvencia minden egyes kb-jának amplifikációjához.

A PCR után a terméket gélre kell tölteni (2D ábra). A megfelelő sávot el kell vágni, és a DNS-t ki kell vonni. A PCR-termék szekvenálása elengedhetetlen, mivel a PCR-termék tartalmazhat mutációkat. Számos PCR-klónozó készlet áll rendelkezésre, amelyek közül néhányat a 2. táblázat mutat be. Mi a pJET1.2/blunt klónozó vektort használtuk (Thermo Scientific, szabadalmi kiadvány: US 2009/0042249 A1, Genbank hozzáférési szám: EF694056.1), és a PCR-terméket a linearizált vektorba klónoztuk. Ez a vektor tartalmaz egy letális gént (eco47IR), amely abban az esetben aktiválódik, ha a vektor cirkularizálódik. Ha azonban a PCR-terméket a letális génen belüli klónozási helyre klónozzuk, ez utóbbi megszakad, lehetővé téve a baktériumok számára, hogy a transzformáció során kolóniákat növesszenek. A PCR-terméket nem tartalmazó cirkularizált vektorok a toxikus gént expresszálják, amely ezért elpusztítja a baktériumokat, kizárva a telepek kialakulását. A baktériumklónokat ezután tenyészteni kell, a plazmid DNS-t pedig egymás után izolálni és szekvenálni kell. Az izolált plazmid minősége elengedhetetlen az optimális szekvenálási eredményekhez. A plazmid DNS-t összesen 1,5 ml tenyésztett baktériumból izoláltuk (hozam 6 μg DNS; OD 260/280 = 1,86; OD 260/230 = 2,17) plazmid mini-preparation kit (QIAGEN) segítségével. A PCR teljes folyamata, beleértve a PCR-termék szekvenáló vektorba történő klónozását és a baktériumok transzfekcióját a szekvenáló vektorral egy nap alatt elvégezhető. Másnap a bakteriális klónokat egy éjszakán át tenyésztik, mielőtt elküldik szekvenálásra.

A szekvenálási adatok elemzése

A szekvenáló cégek a szekvenálási adatokat általában FASTA-fájlként és kész nukleotidszekvenciaként is közlik e-mailben. A szekvenciaelemzéshez a következő weboldalak használhatók:

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

http://xylian.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi

Itt az első weboldalra koncentrálunk. Ezen a weboldalon kattintson a “nucleotide blast” opcióra (4A. ábra). Egy új ablak nyílik meg. Alapértelmezés szerint a “blastn” (blast nucleotide sequences) opció be van jelölve (4B ábra). Ezután jelölje be a “Align two or more sequences” (Két vagy több szekvencia összehangolása) mögötti négyzetet. Most két doboz jelenik meg. Az “Enter Query Sequence” mezőbe (a felső mezőbe) illessze be az Önt érdeklő gén kívánt szekvenciáját, amelyet a PCR-primerekhez már megtervezett restrikciós helyek szegélyeznek. Az “Enter Subject Sequence” mezőbe (az alsó mezőbe) adja be a szekvenciát, vagy töltse fel a szekvenáló cégtől kapott FASTA fájlt. Ezután kattintson az oldal alján található “BLAST” gombra. Néhány másodperc múlva az eredmények egy másik oldalon jelennek meg. Az illesztési adatok egy része a 4C. ábrán látható. Az értelmezéshez a következő pontokat kell figyelembe venni: 1) az azonos nukleotidok számának (az “Azonosságok” pont alatt látható) meg kell egyeznie a kívánt gén nukleotidszámával. Példánkban a tdTomato gén nukleotidszáma a restrikciós enzimhelyekkel és a Kozak-szekvenciával együtt 735 volt. Ez megegyezik a bejelentett számmal (4C ábra). 2) A szekvenciaazonosságnak (az “Azonosságok” pont alatt) 100%-osnak kell lennie. Előfordul, hogy a szekvenciaazonosság 100%-os, de az azonos nukleotidok száma alacsonyabb a vártnál. Ez akkor fordulhat elő, ha egy vagy több kiindulási nukleotid hiányzik. Ne feledje, hogy minden szekvenálási technológiának van hibaaránya. A Sanger-szekvenálás esetében ez a hibaarány a jelentések szerint 0,001% és 1% között mozog. A nukleotidok cseréje, deléciója vagy beillesztése a szekvenálási eredmények elemzésével azonosítható. Ezért ha a szekvenciaazonosság nem éri el a 100%-ot, a plazmidot újra kell szekvenálni, hogy a PCR hibáit meg lehessen különböztetni az egyszerű szekvenálási hibáktól. 3) Hézagok (a “Hézagok” pont alatt) nem lehetnek jelen. Ha hézagok fordulnak elő, a plazmidot újra kell szekvenálni.

A PCR-termék szekvenciaelemzése az NCBI BLAST platform segítségével. (A) Az NCBI BLAST weboldalán a “nucleotide blast” opciót választottuk (ovális vonallal jelölve). (B) Alapértelmezés szerint a “blastn” opció jelenik meg (körrel jelölve). A “Enter Query Sequence” és “Enter Subject Sequence” mezőkbe be kell írni a keresett gén szekvenciáját (a PCR-primerekhez korábban megtervezett restrikciós helyekkel szegélyezve) és a PCR-terméket. A szekvenciák FASTA fájlként is feltölthetők. (C) Az első 60 nukleotid nukleotid igazítása látható. A szekvenciaelemzés szempontjából két fontos elemet ovális vonalakkal jelölünk.

A Sanger-szekvenálásnál az olvasás átlagos hossza, vagyis a leolvasás hossza legalább 800-900 nukleotid. A pJET vektor esetében a teljes gén szekvenálásához egy forward és egy reverse primert kell használni. Ezek a primerek általában 1800 bp-ig terjedő génméretet tudnak lefedni. Ha a gén mérete 1800 bp-nál nagyobb, akkor minden további 800 nukleotidra külön primert kell tervezni. Mivel a megbízható bázismeghatározás nem közvetlenül a primer után kezdődik, hanem körülbelül 45-55 nukleotiddal a primer után, a következő forward primert úgy kell megtervezni, hogy a gén elejétől számított körülbelül 700 nukleotid után kezdődjön. E primerek tervezéséhez különböző weboldalakat lehet használni, többek között a következőket:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer

http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/sequencing_primer_design

Mivel a PCR-termék mérete ebben a példában 735 bp hosszú, a pJET szekvenáló primerek méretén belül volt.

A szekvencia-ellenőrzött klón kiválasztása után a vektor és az inzert plazmidokat AgeI és SalI restrikciós enzimekkel emésztettük (5. ábra). Ezt követte a fragmentumok géltisztítása és ligálása. A kompetens E. coli transzformációja a ligációs keverékkel több klónt eredményezett, amelyeket restrikciós enzimekkel vizsgáltunk. Nyolc klónt vizsgáltunk, amelyek mindegyike tartalmazta a tdTomato inszertet (6. ábra). Fontos, hogy olyan klónokat válasszunk, amelyek nagyok. A szatellit klónok esetleg nem a megfelelő konstrukciót tartalmazzák. Egy gyors plazmid mini-előkészítő készletet (Zymo Research) használtunk a plazmid kivonásához 0,6 ml baktériumszuszpenzióból. A hozam és a tisztaság kielégítő volt a restrikciós enzim alapú szűréshez (2,3 μg DNS; OD 260/280 = 1,82; OD 260/230 = 1,41). A nagyméretű plazmidtisztításhoz egy maxi-preparation kit (QIAGEN) segítségével 450 ml baktériumtenyészetből extraháltuk a plazmidot (hozam 787 μg DNS; OD 260/280 = 1,89; OD 260/230 = 2,22). A pBR322-ből származó plazmid izolálásának várható hozama 1,5 ml és 500 ml baktériumtenyészetből körülbelül 2-5 μg, illetve 500-4000 μg DNS.

Vektor és insert plazmid térképek A) A PCR-terméket tartalmazó CloneJET plazmid illusztrációja. A PCR-termék beillesztése a plazmid klónozási helyére megbontja a toxikus gén eco47IR integritását, és lehetővé teszi a transzgénpozitív klónok növekedését. A plazmidot az AgeI és SalI enzimekkel vágtuk fel, két 3 kb és 0,7 kb méretű fragmentumot létrehozva. A 0,7 kb-os fragmentumot (tdTomato gén) használtuk inzertként a klónozáshoz. (B) A vektorplazmid illusztrációja. A plazmidot AgeI és SalI enzimekkel vágtuk fel, két 4,9 kb és 0,7 kb méretű fragmentumot létrehozva. A 4,9 kb-os fragmentumot használtuk vektorként a klónozáshoz. AMP: Ampicillinrezisztencia gén; PRE: poszttranszkripciós szabályozó elem; MPSV: myeloproliferatív szarkóma vírus promóter.

A kész plazmid szűrése restrikciós enzimekkel. A végleges plazmid illusztrációja látható. A szűréshez a plazmidot a BsiwI enzimmel vágtuk át, így két 4,8 kb és 0,8 kb méretű fragmentum keletkezett. AMP: Ampicillinrezisztencia gén; PRE: poszttranszkripciós szabályozó elem; MPSV: myeloproliferatív szarkóma vírus promóter.

Egyes plazmidok hajlamosak rekombinálni a bakteriális gazdaszervezeten belül, így inszerciók, deléciók és rekombinációk jönnek létre. Ezekben az esetekben hasznos lehet egy recA-deficiens E. coli használata (1. táblázat). Továbbá, ha a GOI toxikus, a baktériumok alacsonyabb hőmérsékleten (25-30 °C) történő inkubálása és ABLE C vagy ABLE K törzsek használata megkerülheti a problémát.

Virális előállítás és célsejtek transzdukciója

A klónozott gén in vitro expressziójának vizsgálatához HEK293T sejteket transzfektáltunk a tdTomato gént, az alfaretrovirális Gag/Pol-t és a vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVG) burkot kódoló plazmidokkal. Ezek a sejtek, amelyek emberi embrionális veséből származnak, könnyen tenyészthetők és könnyen transzfektálhatók. Ezért széles körben használják őket a biotechnológiában és a génterápiában vírusrészecskék előállítására. A HEK293T sejteket minden második nap meleg tápfolyadékkal kell osztani. Az optimális eredmények eléréséhez nem érhetik el a 100%-os konfluenciát. A jó transzfekciós hatékonyság érdekében ezeket a sejteket legalább egy hétig kell tenyészteni, hogy log-fázisban legyenek. A transzfekciós hatékonyság 22% volt, amit a tdTomato 24 órával későbbi fluoreszcens mikroszkópiás expressziója alapján határoztunk meg (7A-B ábra). A tdTomato gént expresszáló egér leukémiás sejtvonal létrehozásához az immunterápiás vizsgálatokhoz a C1498 leukémiás sejteket frissen begyűjtött vírussal transzdukáltuk (36 órával a transzfekció után). Képalkotó vizsgálatok (7C ábra) és áramlási citometriai elemzés (7D ábra) négy nappal a transzdukció után megerősítették a tdTomato expresszióját a sejtek többségében.

A klónozott gén in vitro expressziójának értékelése. (A, B) HEK293T sejteket transzfektáltunk Gag/Pol, VSVG és tdTomato plazmidokkal. A tdTomato gén expresszióját fluoreszcens mikroszkóp segítségével értékeltük. A fluoreszcens képeket fényesmezős képre szuperponáltuk a pozitívan transzdukált sejtek megkülönböztetéséhez. A transzfekció hatékonyságát a tdTomato expressziója alapján határoztuk meg 24 óra elteltével. Kontrollként nem transzfektált HEK293T sejteket használtunk (kék hisztogram). (C, D) A C1498-as egér leukémiás sejtvonalat friss vírussal transzdukáltuk. Négy nappal később a transzgén expresszióját fluoreszcens mikroszkópiával (C) és áramlási citometriával (D) értékeltük. A nem transzdukált C1498 sejteket kontrollként használtuk (kék hisztogram). A méretarányos sávok 30 μm-t jelentenek.