Abstract

A Mycobacterium genus számos zoonózisos betegséget okoz. A legismertebb példa a M. bovis okozta zoonózisos tuberkulózis. Sokkal kevesebbet tudunk a “nem tuberkulózus mikobaktériumokról (NTM)”, amelyek szintén társulnak az emberi fertőzésekhez. A NOM-ZOO-031-1995 mexikói szabvány szabályozza az M. bovis jelenlétét a szarvasmarhákban; az NTM fajokra vonatkozóan azonban nem létezik szabályozás. E vizsgálat célja az volt, hogy a Mexikó állam déli régiójának helyi állományainak szarvasmarháiból izolálja és azonosítsa a nem-tuberkulózus mikobaktériumfajokat a 23S rRNS-gén 100 bp molekuláris markerének azonosítása és kimutatása révén, a 16S rRNS-gén későbbi szekvenálásával. Tejmintákat (35) és orrváladékmintákat (68) gyűjtöttek. A 108 izolált törzsből 39 törzset választottunk ki azonosításra. Az orrváladékból izolált tizenhárom törzs felszaporította a 100 bp molekuláris markert, és M. neoaurum (hat törzs), M. parafortuitum (négy törzs), M. moriokaense (két törzs) és M. confluentis (egy törzs) néven azonosították őket. A M. parafortuitum kivételével a többi azonosított faj közegészségügyi és állategészségügyi aggodalomra ad okot, mivel patogén hatással vannak az emberekre, különösen az alapbetegségben szenvedőkre.

1. Bevezetés

A Mycobacterium nemzetség számos zoonózisos betegséget okoz. A legismertebb példa a M. bovis okozta zoonózisos tuberkulózis, amelynek fő rezervoárja a szarvasmarha. A M. bovis a “tuberkulózis-komplexum” része, amely a M. tuberculosis, M. africanum, M. caprae és M. microti fajokat is magában foglalja.

A mikobaktériumcsoporton belül vannak a “nem tuberkulózus mikobaktériumok (NTM)”, amelyek szintén kapcsolatba hozhatók emberi fertőzésekkel. Az NTM-ek különböző környezeti forrásokban, például a talajban, vízben, növényzetben, állatokban, tejtermékekben és ürülékben találhatók, és véletlenül belégzéssel, lenyeléssel vagy bőrbehatolással terjedhetnek .

A NOM-ZOO-031-1995 mexikói szabvány szabályozza az M. bovis jelenlétét a szarvasmarhákban a szarvasmarha-tuberkulózis (bTB) ellenőrzése és felszámolása érdekében; az NTM-fajokra vonatkozóan azonban nem létezik szabályozás. A szarvasmarha-tuberkulózis hivatalos diagnózisa az M. bovis jelenléte miatt terepi szinten a tisztított fehérjeszármazékot (tuberkulin) használó intradermális teszten alapul. Bár több éve használják, ez a teszt nem nyújt jó érzékenységet és specificitást. A tuberkulózisos állatok körülbelül 20%-a nem reagál a tesztre , és más mikobaktériumfajok – mind a tuberkulózis komplex, mind az NTM fajok – jelenléte interferenciát okoz, ami hamis pozitív és hamis negatív diagnózishoz vezet.

Bár Mexikó rendelkezik szabályozási normával, egyes területekről 2% feletti bTB prevalenciát jelentettek . Tekintettel a tuberkulin teszt gyenge specificitására és érzékenységére, a M. bovis tényleges jelenléte valószínűleg alacsonyabb, illetve a szarvasmarhák más mikobaktériumokkal való fertőzöttsége valószínűleg magasabb. Így a szarvasmarha-tenyésztők, állatorvosok, technikusok és az állattenyésztési ágazatban dolgozó alkalmazottak foglalkozásuknál fogva ki lehetnek téve az M. bovis és az NTM fertőzéseknek. Nagyon keveset tudunk az NTM fajok okozta zoonózisoknak való foglalkozási expozícióról, mivel e fajok azonosítása meglehetősen nehéz feladat volt a molekuláris biológián alapuló azonosítási technikák kifejlesztése előtt.

A mikobaktériumok által okozott betegségek diagnosztizálására jelenleg leggyakrabban használt molekuláris biológiai technikák a restrikciós fragmenthosszúságú polimorfizmus (RFLP) az M. tuberculosis , a spoligotipizálás a M. bovis diagnózisára , és a Gram-pozitív baktériumokra jellemző, magas guanin-citozin (HGC) tartalmú, a 23S rRNS génen található 100 bázispár (bp) “specifikus inszerció” kimutatása, amelyet a baktériumok e csoportjának molekuláris markerének tartanak , majd a 16S rRNS gén szekvenciaelemzése a baktériumok fajszintű azonosítására .

A fent említett technikákkal azonosított NTM fajok közül a M. balnei, a M. marinum és a M. platypoecilus, amelyek felületes és mély bőrelváltozásokat okoztak ; a M. kansasii a tüdőelváltozásokból ; a M. simiae az általános fertőzésekből ; a M. . scrofulaceum a bőr és a belső szervek fertőzéseiből ; M. szulgai tüdőfertőzésekkel, csontvelőgyulladással, tenosynovitisszel és nyirokcsomó-gyulladással társult ; M. ulcerans bőr alatti granulómákkal társult ; M. fortuitum és M. chelonae, amelyek vasculitisszel, endocarditisszel, osteomyelitisszel, mediastinitisszel, meningitisszel, keratitisszel és hepatitisszel társulnak ; M. abscessus, amely erythemás elváltozásokkal társul, amelyek fekélyes csomókká fejlődnek ; és egyéb fajok.

A mexikói állam szarvasmarha-állományának legnagyobb százaléka a déli régióban összpontosul, és az egyik fő gazdasági tevékenység a szarvasmarhatartás . A szarvasmarha-ellenőrzésre vonatkozó NOM-ZOO-031-1995 mexikói rendelet csak a tuberkulinpróbára összpontosít a M. bovis diagnózisára. Keveset tudunk az NTM jelenlétéről a régió szarvasmarháiban. Tekintettel arra, hogy a 23S rRNS gén 100 bázispár molekuláris markerének kimutatásával és a 16S rRNS gén későbbi szekvenálásával lehetőség van az aktinobaktérium fajok azonosítására, lehetséges a fent említett NTM fajok azonosítása.

A jelen tanulmány célja az NTM fajok izolálása és azonosítása volt Mexikó állam déli régiójának szarvasmarháiból. A Mycobacterium fajokat orrváladékból és szarvasmarhatejből vett mintákból izoláltuk, és a 23S rRNS génben lévő 100 bázispár molekuláris marker kimutatásával, majd a 16S rRNS gén szekvenálásával azonosítottuk.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Az NTM-fajok azonosítása a 23S rRNS génben. Mintavételezés

A mintavételt a Zaragoza et al. 2015 által Mexikó államban végzett, szarvasmarha-tuberkulózisra pozitív állományok területi eloszlása alapján végeztük . Négy szarvasmarha-állományt választottak ki Mexikó állam déli régiójában, egy Temascaltepec településhez tartozó állományt és három Zacazonapan településhez tartozó állományt. Összesen 103 mintát gyűjtöttek, 35 tejmintát és 68 mintát orrváladékból. Az egyes állományokból gyűjtött minták számának és típusának megoszlását az 1. táblázat mutatja.

.

.

Jellemző Hord 1 Hord 2 Hord 3 Hord 4 összesen
Község Temascaltepec Zacazonapan Zacazonapan Zacazonapan Zacazonapan
Fajták F1 svájci.Cebu Holstein fríz Holstein fríz Holstein fríz
Geográfiai elhelyezkedés La-19°03′13.7′′Lo-100°13′36.7′′ La-19°03′39.5′′Lo-100°16′30.9′′ La-19°04′0.4′′Lo-100°15′11.5′′ La-19°03′41′′Lo-100°16′06′′′
A bTB története Prevalencia Prevalencia Prevalencia Prevalencia Prevalencia Prevalencia
Vett minták
Tej 15 20 0 0 35
Nazális váladék 0 18 23 27 68
103
La: szélességi fok; Lo: hosszúsági fok; bTB: szarvasmarha-tuberkulózis. a Mexikó Állam Állattenyésztési és Állatvédelmi Bizottságától kaptuk.
1. táblázat
A Mexikó Állam déli régiójának szarvasmarha-állományaiban gyűjtött minták.

2.2. táblázat. A tej- és orrváladékminták vétele

A tőgyet és a mellbimbókat tisztított vízzel és szappannal megtisztítottuk, majd papírtörlővel megszárítottuk, és ezt követően 70%-os alkoholba áztatott tamponokkal elvégeztük a mellbimbó fertőtlenítését. Öt milliliter tejet gyűjtöttünk közvetlenül a mellbimbóból steril 20 ml-es edényekbe, a kezdeti folyást elvetve. Az orrváladékot közvetlenül az orrnyílás belsejéből gyűjtöttük egy 10 cm hosszú steril tampon segítségével, amelyet ezután izotóniás sóoldatba (0,85%) merítettünk. A tej- és orrváladékmintákat a feldolgozásig 4°C-on tároltuk.

2.3. A minták feldolgozása
2.3.1. A mikobaktériumok izolálása

A tejmintákat 10 percig 2500 percenkénti fordulatszámon (rpm) centrifugáltuk. A tej- és orrváladékmintákból származó pelleteket a következő, mikobaktériumokra szelektív táptalajba oltottuk: Stonebrink (BD BBL 220504), Middlebrook (BD BBL 254521) és Middlebrook (BD BBL 254521), kiegészítve 6 g nátrium-piruváttal literenként (Middlebrook-P). A beoltott táptalajokat 37°C-on inkubáltuk 8 hétig, és 3 naponta értékeltük.

2.3.2. Az izolált törzsek osztályozása

Az izolált törzseket a következő jellemzők szerint csoportokra osztottuk: kolónia pigmentációja, növekedési idő és kolóniajellemzők (alak, állag, textúra és pigmenttermelés). Az izolált törzseket Ziehl-Neelsen-festéssel festették meg, hogy megerősítsék a saválló bacilusok (AFB) jelenlétét .

2.4. DNS kivonás

A mikobaktériumokhoz hasonló mikroszkópos jellemzőkkel rendelkező törzseket (saválló baktérium pozitivitás) és minden csoportból két reprezentatív törzset választottunk ki azonosításra. A biomassza kinyeréséhez a törzseket 30 ml Middlebrook folyékony táptalajba (BD BBL 254521) oltottuk be 125 ml-es lombikokban, és 37°C-on inkubáltuk 7 napig. A folyékony táptalajt steril 15 ml-es Falcon-csövekbe töltöttük, és 15 percig 14 000 rpm-en centrifugáltuk. Ezután a felülúszót eltávolítottuk, és a pelletet 1,5 ml-es Eppendorf-csövekbe helyeztük át; a csöveket ezután 14 000 rpm-en × 5 percig centrifugáltuk, majd a felülúszót elvetettük. Az így kapott pelletből a Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega A1120) segítségével végeztük el a DNS extrakciót.

2.5. A molekuláris marker kimutatása a 23S rRNS génben

A 23S rRNS génben található 100 bp molekuláris markert a Roller et al. által leírt módszertan szerint amplifikáltuk. (1992) által kidolgozott módszer szerint a következő primerek felhasználásával : 23S InsF, 5′-(AC)A(AGT)GCGTAG(AGCT)CGA(AT)GG-3′, és 23S InsR, 5′-GTG(AT)CGGTTT(AGCT)(GCT)GGTA-3′.

A reakciót kereskedelmi forgalomban kapható Taq DNS-polimerázzal (Promega M1661) végeztük. A következő termikus cikluskörülményeket alkalmaztuk: 5 percig tartó elődenaturációs lépés (94°C); 29 ciklus denaturáció 30 másodpercig (94°C), 45 másodpercig tartó hibridizáció (46°C) és 50 másodpercig tartó elongáció (72°C); és végül egy 5 perces posztelongációs ciklus (72°C). Az amplifikált fragmentumokat etídium-bromiddal (SIGMA 46065) festett 2%-os agaróz gélen igazoltuk.

2.6. A 16S rRNS gén amplifikálása

A 100 bp filogenetikai markert amplifikáló törzseket kiválasztottuk a 16S rRNS szekvenálási elemzéshez. Az amplifikációhoz a következő primereket használtuk: 8f: AGAGTTTTGATCMTGGCTCAG és 1492r: TACGGYTACCTTGTTACTACGGACTT.

A reakciót kereskedelmi forgalomban kapható Taq DNS-polimerázzal (Promega M1661) végeztük. A következő termikus cikluskörülményeket alkalmaztuk: egy elődenaturációs lépés 5 percig (94°C); 34 ciklus denaturáció 30 másodpercig (94°C), hibridizáció 20 másodpercig (52°C) és elongáció 1 perc 30 másodpercig (72°C); és végül egy 7 perces posztelongációs ciklus (72°C).

A felerősített fragmentumokat etídium-bromiddal (SIGMA 46065) festett 1%-os agaróz gélen igazoltuk. Az amplifikáció termékeit Amicon Ultra Filter® kit (Millipore UFC901008) segítségével tisztítottuk, majd 1%-os agaróz gélen igazoltuk a jelenlétüket és minőségüket.

2.7. Az amplifikáció során keletkezett termékeket az Amicon Ultra Filter® kit segítségével tisztítottuk. A Mycobacterium-fajok azonosítása

A 16S rRNS gén amplifikált termékeit elküldtük a Macrogen Sequencing Service-nek (Maryland, USA). A kapott szekvenciákat a BioEdit program segítségével elemezték és korrigálták. Az elülső és fordított fragmentumokból konszenzus szekvenciákat képeztünk, amelyeket a BLAST program és az EzTaxon 2.1 .

2.8 segítségével összehasonlítottunk a National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBankjában korábban letétbe helyezett szekvenciákkal. Filogenetikai elemzés

A 16S rRNS gén szekvenciáit a következő mikobaktériumfajok esetében szereztük be az American Type Culture Collection (ATCC) és a German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSM) adatbázisából: M. neoaurum ATCC25795, M. parafortuitum DSM43528, M. moriokaense és M. confluentis . A gyűjteményi törzsek és a jelen vizsgálatban izolált törzsek szekvenciáit a BioEdit programmal összehangoltuk. A filogenetikai elemzést a MEGA szoftver 4. verziójában a maximális parszimónia módszerével végeztük. A kladogram gyökerének kialakításához a Pantoea agglomerans DSM 3493 szekvenciáját használtuk.

3. Eredmények

A 103 gyűjtött mintából izolált 108 törzs makroszkopikus és mikroszkópos morfológiai jellemzőik alapján 13 csoportba oszlott (2. táblázat). A 11. és 12. csoportot különösen a saválló törzsek alkották.

.

Group Number of Strains Morphological characteristics Molecular marker (bp)
Mikroszkópos Mikroszkópos 23S rRNS
Pigmentáció Megjelenés Ziehl-Neelsen
1 29 Sárga Krémszínű – 250
2 10 Fehér Krémszínű – 250
3 14 Fehér Száraz – 250
4 2 Salmon Krémszínű – 250
5 2 Lalmon Száraz – 250
6 2 Fehér, sötét krémszínű – 250
7 2 Fehér Krémszínű – 250
8 3 Fehér, sötét száraz – 250
9 4 fehér száraz – 250
10 10 fehér krémes, száraz – 250
11 10 Fehér száraz + 350 és 250
12 7 sárga Krémszínű + 350
13 13 Fehér száraz – 250
-: saválló bacilusok hiánya; +: saválló bacilusok jelenléte; Bp: bázispárok.
2. táblázat
Az izolált törzseket morfológiai jellemzőik és a 23S rRNS-génen található molekuláris marker (100 bp) jelenléte alapján csoportosítottuk.

A fajszintű azonosításhoz 39 törzset választottunk ki: közülük 10 a 11., 7 a 12. csoportba tartozott. A fennmaradó 11 csoport mindegyikéből két törzset választottak ki, hogy teljes legyen a 39 törzs. A 100 bp molekuláris markert a kiválasztott törzsek 33%-ában (13/39) találták meg. Ezek esetében a 16S rRNS-gént amplifikálták a szekvenálás és a fajszintű azonosítás céljából.

A gyűjtött mintákban az NTM általános prevalenciája 12,6% (13/103) volt, mind a tej-, mind az orrváladékmintákat figyelembe véve. Az orrváladék minták specifikus prevalenciája azonban 19,1% (13/68) volt.

A szekvencia-összehasonlítás alapján a Mycobacterium nemzetség négy NTM faját azonosították; a törzsek 64%-a (6/13) 98%-os és 99%-os hasonlóságot mutatott a M. neoaurummal, míg 31%-uk (4/13) 99%-os hasonlóságot mutatott a M. parafortuitummal, 15%-uk (2/13) 98%-os és 99%-os hasonlóságot a M. moriokaense-vel, és végül 8%-uk (1/13) 99%-os hasonlóságot a M. confluentisszel (3. táblázat).

Törzs Az állomány eredete Kultúrközeg Amplifikáció. fragmentum mérete (bp) Hasonlóság (Blast) % Hasonlóság (EzTaxon) %
1-AZ 2 Middlebrook 1428 M. neoaurum 98 M. neoaurum 98.3
2-AZ 2 Stonebrink 1408 M. neoaurum M. neoaurum 99 M. neoaurum 99.1
3-AZ 2 Stonebrink 1428 M. neoaurum M. neoaurum 98 M. neoaurum 98.2
5-AZ 3 Stonebrink 1416 M. neoaurum 99 M. neoaurum . neoaurum 99.2
8-AZ 4 Middlebrook 1415 M. neoaurum 99 M. neoaurum 99.0
12-AZ 2 Middlebrook 1415 M. neoaurum M. neoaurum 99 M. neoaurum 99.4
4-AZ 4 Middlebrook-P 1420 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.2
9-AZ 3 Middlebrook 1415 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.9
10-AZ 4 Stonebrink 1411 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.4
11-AZ 3 Stonebrink 1414 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.2
6-AZ 2 Stonebrink 1455 M. moriokaense 99 M. moriokaense 98.2
13-AZ 4 Stonebrink 1417 M. moriokaense 98 M. moriokaense 98.2
7-AZ 2 Middlebrook-P 1420 M. confluentis 99 M. confluentis 99.1
2: Zacazonapan Holstein-F; 3: Zacazonapan Holstein-F; 4: Zacazonapan Holstein-F.
3. táblázat
A szarvasmarhából izolált törzsek 16S rRNS génszekvenciáinak összehasonlítása a GenBankban dokumentáltakkal, BLAST és EzTaxon segítségével.

A Mycobacterium nemzetséggel és négy fajával kialakítottuk a filogenetikai fát, amelynek segítségével a gyűjteményi törzsek és a jelen vizsgálatban izolált törzsek közötti filogenetikai kapcsolatokat figyeltük meg (1. ábra).

1. ábra
Az izolált és a referencia törzsek 16S rRNS génszekvenciáinak összehasonlításával konstruált filogenetikai fa.

4. Megbeszélés

Az NTM-fajokat kizárólag orrváladékból származó mintákból izolálták, ami kizárta a vizsgálat egyik helyi gazdaságából származó mintákat (1. táblázat). Megállapítottuk, hogy a specifikus prevalencia 19,1% volt Mexikó állam déli régiójának állományaiban. Az Egyesült Államokban, Dél-Afrikában, Tanzániában és Brazíliában végzett hasonló vizsgálatok 3,4%-os, 24,5%-os, 7%-os, illetve 7,8%-os NTM-prevalenciáról számoltak be; ezért az ebben a vizsgálatban talált prevalenciaérték a korábban közölt tartományon belül van. Ebben a vizsgálatban a 39 elemzett törzsből 13-at a M. neoaurum, M. moriokaense, M. confluentis és M. parafortuitum NTM fajként azonosítottak.

M. neoaurum, a Mycobacterium parafortuitum komplex tagja, a betegségek széles spektrumáért felelős, legtöbbjük eszközzel kapcsolatos fertőzésekért, mint például Hickman-katéterek, BROVIAC-katéterek, PICC-vezetékek , arteriovenosus fisztula, amely tartalmazott egy politeetrafluoretilén graftot , pace makerek és protézisbillentyű-endokarditis . Az ezeket az eszközöket tartó immunhiányos betegek a fő gazdatestek, például a rákos betegek és a veseelégtelenségben és szívproblémákban szenvedő cukorbetegek . A M. neoaurumot vizeletfertőzésben , meningoencephalitisben és a központi idegrendszeri elváltozásokban , bakteriémia és endokarditisben , valamint tüdőfertőzésben szenvedő betegekből is izolálták. Bár elsősorban klinikai esetekből izolálták, vannak jelentések tejből és szarvasmarhából történő izolálásáról is .

M. moriokaense-t köpetmintából izolálták . Bár az emberre nézve nem tekinthető patogénnek, mégis összefüggésbe hozták tüdőbetegségekkel . A M. confluentis-t is izolálták köpetmintából , és a M. parafortuitummal együtt mindkettőt nem patogén fajnak tekintik. A M. confluentist, a M. moriokaense-t és a M. neoaurumot különböző szarvasmarhafélék és vadon élő állatok tuberkulózisos elváltozással járó szöveteiből izolálták, míg a M. parafortuitumot csak szarvasmarhafélék tejéből izolálták . Munkánk során azonban a M. parafortuitumot csak orrváladék mintákból izolálták.

A mikobaktériumok táplálkozási igényei különböznek a különböző fajok között, ami a különböző táptalajok használatának oka volt. Figyelemre méltó, hogy az ebben a vizsgálatban azonosított 13 törzsből hét törzset Stonebrink táptalajon izoláltak, köztük a M. neoaurumot, a M. parafortuitumot és a M. moriokaense-t is. Ez az eredmény összhangban van a Sepúlveda és munkatársai által leírtakkal, akik szerint a Stonebrink táptalaj alkalmas a Mycobacterium nemzetség különböző fajainak kinyerésére. García-Martos és García-Agudo arról számolt be, hogy a Middlebrook táptalaj optimális az aktinomiciták izolálására, ami összhangban van a jelen vizsgálattal, figyelembe véve, hogy két fajt, a M. neoaurumot és a M. parafortuitumot izolálták ebben a táptalajban. Figyelemre méltó, hogy a M. confluentist csak nátrium-piruváttal kiegészített Middlebrook táptalajon izolálták; így a különböző táptalajok használatának stratégiája megfelelő volt, mert lehetővé tette a Mycobacterium nemzetség különböző fajainak izolálását.

A Gram-pozitív baktériumok 23S rRNS génjében jelen lévő molekuláris marker kimutatása HGC-tartalommal lehetővé tette az eubaktérium és a mikobaktérium törzsek megkülönböztetését. A 16S rRNS gén szekvenciaelemzése lehetővé tette a fajszintű azonosítást, ezért e módszerek kombinációja alkalmas az NTM fajok azonosítására.

5. Következtetések

A jelen tanulmányban leírt módszertan alkalmazásával négy NTM-fajt sikerült izolálni és azonosítani: M. confluentis, M. moriokaense, M. neoaurum és M. parafortuitum. Ezeket a fajokat először izolálták Mexikó állam déli régiójából származó szarvasmarhák orrváladékából. Az azonosított fajok közül három (M. neoaurum, M. moriokaense és M. confluentis) közegészségügyi és állategészségügyi jelentőségű.

Megjelenés

Ez a munka a PNPC-CONACYT-ben regisztrált, az Egészségügyi Tudományok Doktora (Universidad Autónoma del Estado de México) fokozat megszerzéséhez szükséges szakdolgozatból származik.

Érdekütközések

Minden szerző kijelenti, hogy nem áll fenn semmilyen összeférhetetlenség.

Köszönet

A szerzők szeretnék megköszönni az Universidad Autónoma del Estado de México (UAEMex) kutatási és felsőoktatási titkárságának pénzügyi támogatását az alábbi kutatási támogatások révén: (i) “A földrajzi információs rendszerek és a molekuláris biológiai technikák alkalmazása, mint a Mycobacterium spp. kimutatásának és azonosításának eszközei”, SIEA-UAEM 3486/2013CHT, és (ii) a “Microbiología y química en las Ciencias de la Salud” hálózat, 039/2014RIF.

.