JASCO

Eredmények

Az AMC tripsinhasítás utáni fluoreszcencia-intenzitásának nyomon követésére szolgáló maximális emissziós hullámhossz megtalálása érdekében megmértük a gerjesztési és emissziós spektrumokat, amelyeket az 1. ábra mutat. A maximális emissziós hullámhossz 440 nm-nek bizonyult.

Az enzimoldat mért fluoreszcencia-intenzitásának az izolált AMC koncentrációjára történő standardizálása érdekében titrálást végeztünk és megmértük a fluoreszcenciát. Az 50 µmol/L AMC oldatból 0,5 mL aliquotát adtunk egy 2,5 mL enzimoldathoz, és az izolált AMC kezdeti és végső koncentrációját az 1. táblázatban foglaltuk össze.

1. táblázat. Izolált AMC koncentrációk a fluoreszcencia-intenzitás standardizálása előtt és után.

A tripszin aktivitás kinetikáját ezután az izolált AMC fluoreszcencia intenzitásának mérésével kaptuk meg a tripszin szubsztrátból történő hasításakor. A 2. ábra az időbeli mérést mutatja, miután 2,5 mL enzimoldathoz 0,5 mL Boc-Gln-Ala-Arg-Arg-MCA szubsztrátoldat különböző koncentrációit adtuk.

A Kinetics Analysis program segítségével egy Lineweaver-Burk grafikont (3. ábra) rajzoltunk a 2. ábrán látható fluoreszcencia-időfolyam mérésekből. A Lineweaver-Burk-diagram olyan enzimkinetikai paramétereket szolgáltat, mint a reakció maximális sebessége, Vmax, és a Michaelis-Menten-állandó, Km. A Vmax a reakció sebességét írja le, amikor az enzim telítődik szubsztráttal, míg a Km a maximális reakciósebesség eléréséhez szükséges szubsztrátmennyiséget jelzi. A Vmax 35 270 nmol/L-min-1, a Km pedig 5,99 volt. Az egyenes egyenlete 1/v = 0,000270 – 1/ + 0,0000284.