Immunocitokémiai módszerek, technikák és protokollok

ICC főoldal > Sejtfixálás

A sejteket fixálni és permeabilizálni kell ahhoz, hogy az antitest szabadon hozzáférjen az antigénhez. Általában a fixálás erőssége és ideje lényegesen rövidebb a sejteknél, mint a vastagabb, szerkezetileg összetett szöveti metszeteknél. Immuncitokémia esetén a minta előkészítése lényegében a célsejtek tárgylemezre történő rögzítését jelenti. A tökéletes fixálás immobilizálja az antigéneket, miközben megőrzi az autentikus sejtes és szubcelluláris architektúrát, és lehetővé teszi az antitestek akadálytalan hozzáférését minden sejthez és szubcelluláris kompartmenthez. A fixálószerek széles skáláját használják általában, és a módszer helyes megválasztása a vizsgált antigén jellegétől és a használt antitest tulajdonságaitól függ. A fixáló módszerek általában két osztályba sorolhatók: szerves oldószerek és térhálósító reagensek. A szerves oldószerek, mint például az alkoholok és az aceton eltávolítják a lipideket és dehidratálják a sejteket, miközben kicsapják a fehérjéket a sejtarchitektúrán. A térhálósító reagensek (mint például a paraformaldehid) intermolekuláris hidakat képeznek, általában szabad aminocsoportokon keresztül, és így összekapcsolt antigének hálózatát hozzák létre. A térhálósító reagensek jobban megőrzik a sejtek szerkezetét, mint a szerves oldószerek, de csökkenthetik egyes sejtkomponensek antigén jellegét, és egy permeabilizációs lépés hozzáadása szükséges ahhoz, hogy az antitest hozzáférjen a mintához. A mindkét módszerrel történő fixálás denaturálhatja a fehérjeantigéneket, és emiatt a denaturált fehérjék ellen készített antitestek hasznosabbak lehetnek a sejtfestéshez. Különböző fixálási módszereket ismertetünk. A megfelelő fixálási módszert az adott alkalmazásnak megfelelően kell kiválasztani.

1. Acetonos fixálás

  • Fixáljuk a sejteket -20°C-os acetonban 5-10 percig.

  • Az acetonos fixálást követően nincs szükség permeabilizációs lépésre.

2. Metanolos fixálás

  • Fixáljuk a sejteket -20°C-os metanolban 5-10 percig.

  • A metanolos fixálást követően nincs szükség permeabilizációs lépésre.

3. Etanolos fixálás

  • Fixálja a sejteket hűtött 95%-os etanolban, 5%-os jégecetsavban 5-10 percig.

4. Metanol-aceton fixálás

  • Fixálás hűtött metanolban, 10 percig -20 °C-on.

  • Eltávolítsuk a felesleges metanolt.

  • Permeabilizáljuk hűtött acetonnal 1 percig -20 °C-on.

5. Metanol-aceton keverék fixálás

  • 1:1 metanol és aceton keveréke.

  • A keveréket frissen készítse el, és 5-10 percig fixálja a sejteket -20 C-on.

6. Metanol-etanol keverék fixálás

  • 1:1 metanol és etanol keverék.

  • A keveréket frissen készítse el és 5-10 percig fixálja a sejteket -20 C-on.

7. Formalin fixálás

  • Fixáljuk a sejteket 10% semleges pufferelt formalinban 5-10 percig.

  • Öblítsük át röviden PBS-szel.

  • Permeabilizáljuk 0,5%-os Triton X-100-zal 10 percig.

8. Paraformaldehid-Triton fixálás

  • Fixáljuk 3-4%-os paraformaldehidben 10-20 percig.

  • Öblítsük át röviden PBS-szel.

  • Permeabilizáljuk 0,5%-os Triton X-100-zal 10 percig.

9. Paraformaldehid-metanolos fixálás

  • Fixálás 4%-os paraformaldehidben 10-20 percig.

  • Rövid öblítés PBS-szel.

  • Permeabilizálás lehűtött metanollal 5-10 percig -20 °C-on.