Eredmények és vita

Teljes TE-domén struktúra. Bár az izolált TE-domén megoldott szerkezete két független molekulát (1 és 2) képvisel az aszimmetrikus egységben (1. táblázat), a domén tisztított és teljesen aktív volt monomerként (Z.G. és B.C., publikálatlan adatok). A natív humán FAS fej-farok antipárhuzamos homodimerként rendeződik (1), amint azt a közelmúltban az elektron krio-mikroszkópiás (cryo-EM) térképeken láthatóvá tették (31). Ez az elrendeződés a FAS monomerek két TE-doménjét egymástól ellentétes végekre helyezné, ami nem kölcsönöz funkcionális jelentőséget a dimer kialakulásának. Ezen okok miatt a dimer a kristályosítás műterméke. A továbbiakban az 1-es molekula szerkezetét tekintjük reprezentatív szerkezetnek.

A humán FAS TE-doménje két szubdoménből (A és B) áll (1. ábra). A nagyobbik A szubdomén (≈23 kDa) két nem összefüggő szegmensből áll az amino- (vagy N-) és a karboxil- (vagy C-) terminális végektől (1., 2., 3. ábra). A közbeeső szegmens a kisebb (≈9 kDa) B szubdoménhez tartozik. Az A szubdomén általános α/β hajtással rendelkezik, míg a B szubdomén teljesen α-helikális motívummal. A teljes szerkezet kilenc α-hélixből és nyolc β-szálból áll (1. és 2. ábra). A teljes TE-domén szerkezetének nagy része beilleszthető volt az elektronsűrűségbe, kivéve az 1., 2. és 3. ábrán látható három szegmenst és egy glicinmaradékot, amelyeknek hiányzik vagy gyenge a sűrűsége, ami nagy mobilitásukra utal. A rendezetlen szegmensek mindegyike az oldószerrel exponált régiókban található, és sehol sincsenek a kristálykontaktusokban.

A humán FAS TE három katalitikus maradékát (Ser-2308, His-2481 és Asp-2338) kiterjedt hidrogénkötés-hálózat köti össze egymással és a szomszédos maradékokkal (4. ábra). A Ser-2308 hidroxilcsoportja kooperatív hidrogénkötésben vesz részt, elfogadva a szomszédos Tyr-2309 amidgerincétől és donorálva a His-2481 Nε2-jének. Ez viszont megkönnyítené a Ser-2308 nukleofilként való aktiválását, és segítene stabilizálni a TE katalitikus reakció során várhatóan kialakuló oxianion tetraéderes intermediert, ahogyan azt a szerin-hidrolázoknál láthattuk. A His-2481 maradék (Nε2) viszont hidrogénkötéssel kapcsolódik az Asp-2338-hoz (Oδ2). Az Asp-2338 (Oδ1 atom) további hidrogénkötéseket létesít mind az Ala-2448 gerinc amidjával, mind a Tyr-2462 hidroxilcsoportjával. A Tyr-2462 teljesen változatlan, míg az Ala-2448 részben konzerválódott a rovaroktól az emlősökig (3. ábra). Ezért úgy tűnik, hogy e maradékok és a katalitikus aszpartát-maradék közötti kölcsönhatás fontos az Asp-2338 adott pozícióban tartásához, ami tovább jelzi e maradék fontos szerepét. A katalitikus hely kiterjedt hidrogénkötés-hálózata a katalitikus maradékok orientálásával és a szükséges pozíciókba helyezésével tartja az enzimet működésre felkészülve, hasonlóan a szerin-hidrolázokéhoz (40).

Palmitoil-lánc kötőhely és lánchossz-specifikusság. Annak a mechanizmusnak a megértése érdekében, amellyel a FAS TE-doménje szabályozza a lánchosszspecifikusságot, elemeztük a TE szerkezetét a katalitikus központhoz közeli barázda jelenléte szempontjából, amely hosszú zsír-acilláncú szubsztrátokat képes befogadni. Csak egy barázda jelenléte nyilvánvaló, amely az A és B szubdomén közötti határfelületen található (5. ábra). A proshape (lásd Anyagok és módszerek) segítségével végzett elemzés megerősítette a 186,9 Å3 térfogatú és 140 Å2 felületű barázda jelenlétét, amelynek disztális vége egy zsebet képez (5. ábra). A barázda közel van a TE-domén aminoterminusához, amely a FAS ACP-doménjéhez kapcsolódik, amely a növekvő acilláncokat tartja a TE-domén általi letapogatáshoz és felszabadításhoz, miután elérte az optimális 16 szénatomos zsírsavlánc-hosszúságot. A barázdát szegélyező maradékok többsége a B aldomén α8-as ampifil hélixéből származik. A barázdához hozzájáruló további maradékok a B aldomén α5-ös hélixéből, az A aldomén α1-es N-terminális hélixéből és az A aldomén β2 és α2 közötti hurokból származnak. A barázdát bélelő, többnyire hidrofób természetű maradékok a következők: Phe-2418, Ala-2419, Ser-2422, Phe-2423 és Lys-2426 az α8 spirálból, Phe-2370 és Phe-2371 az α5 spirálból, Leu-2222, Leu-2223 és Val-2224 az α1 spirálból, valamint Ile-2250 és Glu-2251 a β2 és α2 közötti hurokból (5A. ábra). E maradékok közül az Ile-2250, Glu-2251 és Lys-2426 fajonként változatlan, míg a Val-2224, Phe-2371, Ala-2419 és Phe-2423 többnyire konzervált (3. ábra). A többi maradék maradék teljesen konzervált az emlősökben (3. ábra). A fenti megfigyelések együttesen arra utalnak, hogy a két szubdomén közötti határfelület kiváló zsírsavlánc-kötő régió. Két kísérletet végeztünk, hogy hitelt adjunk a feltételezésnek, és betekintést nyerjünk a zsíracillánc-szelektivitásba.

5. ábra.

Lipidkötő hely. (A) Az első 11-12 szénatomra vonatkozó jelölt palmitoilkötő barázda és az utolsó 5-4 szénatomra vonatkozó zseb sztereónézete. A hexadecil-szulfonil inhibitor Corey-Pauling-Koltun térkitöltő modellként van ábrázolva (C, sárga; O, piros; S, zöld). A barázdát bélelő oldalláncok gömbölyded figurákként vannak ábrázolva (C, sárga; O, piros; N, kék). Az aktív központot alkotó oldalláncok szintén gömb-pálcika alakzatokként vannak ábrázolva, a színséma hasonló a maradékok színsémájához. A barázda felszíni térképe zöld dróthálóval van ábrázolva. A barázdát alkotó maradékok fel vannak címkézve, kivéve az Ile-2250-et, amely nem látható, mert az inhibitor alá esik. A szulfonilcsoport kezdeti 11-12 szénatomja oldószerrel exponált, a 11. és 12. szénatom a zseb szájánál van. (B) A barázda és a zseb egy másik nézete. A nyilak jelzik a forgásokat az A-ban látható nézet orientációjától a B-ben látható orientáció felé haladva. Ez a nézet azt mutatja, hogy a hexadecil-inhibitor zsíros acilláncának nagy része ki van téve az oldószernek.

Először is kimutattuk helyirányított mutagenezissel, hogy a TE-domén barázdáját és zsebét bélelő több maradék kicserélése csökkentette a TE-aktivitást, bár eltérő mértékben (2. táblázat).

A táblázat megtekintése:

  • View inline
  • View popup

2. táblázat. A jelölt kötőbarázdában lévő mutációk csökkentik a TE aktivitását

Másodszor, modellezni tudtuk a C16 palmitoil láncot tartalmazó inhibitor hexadecil-szulfonil f luorid (HDSF) kötődését a barázdába. A modellezéshez a palmitoilfehérje TE 1 (PPT1) kovalensen kötött hexadecilszulfonáttal (HDS) rendelkező palmitoilfehérje TE 1 (PPT1) kristályszerkezetének (PDB azonosító kód: 1exw; hivatkozás 41) adatai szolgáltak útmutatásul, és cns-energia-minimalizálással egészítettük ki. A TE-hez hasonlóan a PPT1 katalitikus helye egy konzervált szerin, hisztidin és aszpartát katalitikus triádot tartalmaz. A PPT1-HDS komplex szerkezete kimutatta a kovalens kötés kialakulását a HDS kénatomja és a katalitikus szerin oxigénatomja között, valamint a zsíracillánc jelenlétét a fehérje hosszú, többnyire hidrofób felületi barázdájában (41). A modellezett kovalens kötésű HDS a TE-szerkezetben (5. ábra) a ligandumkötés számos, fontos funkcionális és biokémiai jelentőséggel bíró jellegzetességét tárta fel. A HDS illesztése nem okozott jelentős átrendeződést a kötőhelyen lévő maradékokban. A palmitoil-lánc a szulfonátcsoporthoz képest éles kanyarulatot tesz, hasonlóan a kötött PPT1 szerkezetben látottakhoz. A 16 szénatomos palmitoil-lánc jól illeszkedik a barázdába, az első ≈12 szénatomot az oldószer felé kitéve, a maradék ≈4 szénatomot pedig beillesztve és a distális zsebben tartva. Ez az illeszkedés teljes mértékben összhangban van azzal a megfigyeléssel, hogy az emlősök FAS TE katalizálja a palmitinsav mint fő termék képződését (20). Az utolsó ≈4 szénatomok jelenléte a zsebben segít a zsírsavláncot a helyén tartani a palmitoil-acil szubsztrát hidrolíziséhez. A kötőhely jellege, amely egy exponált barázdát és egy zárt zsebet kombinál, egyedülálló, és ennek a TE-nek a specifitását szolgálja. Az a megállapítás, hogy az emlős FAS-ok TE-doménje nem mutat jelentős aktivitást a 14 szénatomnál rövidebb zsíracilláncokkal szemben (20), azzal magyarázható, hogy a kötődés hiánya és a rövidebb láncok nagyobb mobilitása miatt a kötődés nem produktív. A palmitoil-lánc utolsó ≈4 szénatomjai részben elfoglalják a disztális zsebet, így csak 2 további szénatom befogadására marad elegendő hely. Ez az eredmény összhangban van a 18 szénatomnál hosszabb modellszubsztrátumok esetében tapasztalt drámai aktivitáscsökkenéssel (20). Nem világos, hogy a C16 és C18 zsíracilláncok utolsó ≈4 és ≈6 szénatomjai a két szubdomén közötti előre kialakított zsebbe kerülnek-e, ahogy a nem kötött forma szerkezetében látható, vagy kezdetben a domén egy nyitott formájához kötődnek, amely aztán a szubdomének közötti csuklós hajlító mozgást végez, hogy a zsíracilláncok terminális szénatomjait magába zárja, és létrehozza az aktív hely régiójának produktív konfigurációját.

Megfontolandó erőfeszítéseket tettek a TE kristályosítására a hosszú láncú zsírsavak különböző analógjaival (pl, palmitoil-CoA, mirisztoil-CoA, sztearoil-CoA, palmitinsav, hexadecil-szulfonil-fluorid és palmitinsav), de nem találtak hosszú életű, stabil komplex szerkezeteket. A legtöbb komplex, amint azt független enzimaktivitási vagy radioaktív kötődési vizsgálatok mutatták oldatban, 5 perc és 1 óra között disszociált, így alkalmatlanná váltak a kristályosítási vagy kristályáztatási kísérletekre.

Cryo-EM Fit of TE Structure. Bár a humán FAS dimer 20 Å-s cryo-EM rekonstrukciós szerkezetét már leírták (31), nem volt utalás a FAS alegység N- és C-terminális polaritására, kivéve egy korábbi, antitestjelölésből származó jelzést, miszerint a FAS TE domén a teljes szerkezet egyik végén helyezkedik el (42). Megkíséreltük a polaritás előzetes értékelését a kisebb (32 kDa) humán FAS TE-domén szerkezet kézi dokkolásával, amely a FAS alegység C-terminális végét foglalja el, és a nagyobb (42 kDa) E. coli β-ketoacil-szintáz I (vagy KSI) kristályszerkezetét (PDB azonosító kód: 1ek4) (43), amely az emlős FAS N-terminális KS doménjének közeli homológja, a cryo-EM tömegsűrűségben fejnek és lábnak jelölt monomer egység mindkét végébe (6. ábra). A TE szerkezet jól illeszkedik a lábnak jelölt alstruktúra végéhez, míg a KSI a legjobban a fejnek jelölt alstruktúra végéhez illeszkedik (6. ábra). A FAS dimerben az ACP domén kölcsönhatásba lép mind az azonos monomer TE doménjével, mind az ellentétes monomerben lévő ketoacil-szintáz doménnel, ami két aktív centrum kialakulásához vezet a dimer két végén. A TE-domén és a KS-domén homológjának orientációja a legjobban illeszkedett a lábhoz, illetve a fejhez, ami az ACP-molekula mindkét fehérjével való térbeli és funkcionális kölcsönhatásának egyaránt megfelelt. Amikor a szerkezeteket felcseréltük, az illeszkedés sokkal rosszabb volt, a KSI egyes részei a sűrűségen kívülre estek, és a TE illeszkedésben nagyobb volt az elszámolatlan sűrűség térfogata (6. ábra).

6. ábra.

A TE (zöld gerinces nyomvonal) és a KSI (bordó nyomvonal) előzetes illesztése a 20-Å felbontású krio-EM tömegsűrűséghez. A sűrűségből látható alstruktúrákat Head (Fej), Torso (Törzs) és Foot (Láb) jelöli. A TE nyomvonal a legjobban a Foot nevű alszerkezethez illeszkedik, míg a KSI gerincnyomvonal a Head nevű alszerkezethez illeszkedik a legjobban. A KSI és a TE legjobb illeszkedése pirossal van bekarikázva. A TE és a KSI gerincnyomvonalai a tömegsűrűség alján a fej és a láb esetében kevésbé kielégítő illeszkedést mutatnak. Az intakt FAS korábbi proteolitikus emésztési kísérletei alapján három domént azonosítottak: az I. domént, amely a KS-AT/MT-DH enzimcentrumokat és a linker régiót foglalja magában; a II. domént, amely az ER-KR-ACP régiót foglalja magában; és a III. domént, amelyet a TE-hez rendelnek (1, 2). A Head és a Torso alstruktúrák, amelyek lényegében összeolvadnak, megfelelhetnek az I. doménnek és a II. domén egy részének, a Foot pedig a II. domén és a III. domén többi részét képviselheti.

Következtetések. A humán FAS TE-doménjének kristályszerkezetéből levonható fő következtetések a következők. (i) A TE két szubdoménből áll, amelyek méretben és hajtogatási motívumokban különböznek. (ii) A nagyobb A aldomén α/β motívumot mutat, míg a kisebb B aldomén teljesen helikális. (iii) Az A aldomén hozzájárul a Ser, Asp és His maradékokból álló katalitikus triádhoz. (iv) A B szubdomén és az A szubdomén részei közötti hosszú barázda egy disztális zsebbel alkotja a zsíracillánc-kötőhelyet. E hely geometriája és jellege összhangban van a TE magas specificitásával a C16-C18 zsíracil szubsztrátokkal szemben. A barázda úgy működik, mint egy vonalzó, amely a megfelelő szubsztrát hosszát méri. (v) A TE előzetes illesztése az intakt humán FAS krio-EM szerkezetébe az alegységek N-C terminus polaritását valószínűsíti. Az illeszkedés további ellenőrzéséhez és a FAS működésének mélyreható elemzéséhez azonban nagyobb felbontású cryo-EM térképre van szükség.