Mi a közös a DNS-mini prepekben és a fehérje immunprecipitációs kísérletekben? Másképp kezdődnek, de ugyanazzal a kritikus fázissal – az elúcióval – végződnek. De mi is pontosan az elúció, és mi a lényege?
A terminológia
Először is kezdjük néhány alapvető terminológiával:
Elúció – egy anyag kivonása egy másikból egy oldószerrel történő mosással.
Az adszorbens – szilárd fázis, amely lehet szilikagél a mini-prep oszlopok esetében, de általában gyöngyök, amelyek kovalensen kapcsolódhatnak antitestekhez vagy más ligandum molekulákhoz. A “szilárd fázis” nem feltétlenül jelent álló oszlopot; lehet egy eppendorfban lévő, könnyen mosható gyöngy is.
Affinitás – az abszorbensnek a kiválasztott molekula (amit eluálni próbálunk) megkötésére való képességének mérőszáma. Minél nagyobb a szilárd fázis affinitása a választott biomolekulához (BOC), annál szorosabban kötődik hozzá a molekula. Nem akarjuk azonban, hogy a kötődés irreverzibilis legyen; ez lehetetlenné teszi az elúciót.
Eluens – olyan oldószer, amely eltávolítja a BOC-ot az abszorbensről.
Eluátum – az adszorbensről eltávolított BOC-ot tartalmazó oldószer.
Az anyag előkészítése
Az elúció előtt el kell szívni a választott molekulát, miközben meg kell szabadulni a szennyeződéstől. Ez egy lényeges lépés, mivel a hagyományos bölcsesség arra emlékeztet, hogy “szemét be, szemét ki”. Lehet, hogy kiváló reagensekkel rendelkezik az elúcióhoz, de ha a minta túl sokat tartalmaz a nem kapcsolódó személyzetből (a tudományos kifejezés “gunk”), az eltömíti az adszorpciós anyagot. A szilárd fázis telítődése megakadályozza a BOC felszívódását, majd szennyezi az eluátumot. A hatékony lízis és tisztítási lépések elengedhetetlenek az elúciós kísérlet sikeréhez.
Nagyon fontos az abszorpció előtti anyag térfogatának meghatározása. Az abszorpciós közegen áthaladó lizátum térfogata nem haladhatja meg az oszlop 3-5 térfogatát. Az abszorbens anyagon áthaladó nagy mennyiségű lizátum megnöveli a kísérlet időtartamát, valamint a gunk felszívódásának valószínűségét. Sok esetben érdemes a kiindulási lizátum térfogatát szűréssel vagy frakcionálással csökkenteni. Így a lizátum térfogata határozza meg az oszlop méretét.
Az adszorpciós anyag kiválasztása az Önt érdeklő molekula kémiai összetételétől függ. A biomolekulák abszorpciója általában többé-kevésbé specifikus kölcsönhatással jár a szubsztrát és a molekula között. A DNS például a negatív töltésű DNS-foszfátcsoportok és a pozitív töltésű szilícium-dioxid-részecskék közötti ionos kölcsönhatás miatt abszorbeálódik a minioszlopokon.
A fehérjéket általában IgG-vel borított szefaróz vagy mágneses gyöngyök adszorbeálják.
A kezdeti lizátumfelvitel után az oszlop semmilyen ponton nem száradhat ki. Ez “ráégeti” a molekulát az abszorbensre és megzavarja az oszlop integritását. Ha nincs ideje folytatni a kísérletet, töltse fel az oszlopot kompatibilis pufferrel, és állítsa le az áramlást.
Mosás
A szilárd fázis mosásának célja a nem kapcsolódó anyag eltávolítása, miközben a kívánt molekula az oszlopon marad. A szelektív elválasztást gyakran alacsony ionerősségű (pl. alacsony sókoncentrációjú) puffer használatával érik el. A mosópuffer térfogatának közel azonosnak kell lennie a kiindulási anyag mennyiségével, és legalább 3-5 térfogatot kell kitennie az oszlopnak.
Az oszlopon áthaladó több térfogat mosópuffer után azonban a szennyeződések kimosódnak, és minden további mosás nem javítja a prep minőségét. Sőt, elkezdi elveszíteni a célanyagot.
Elúzió
Kép: Sephadex G-50 Superfine-on elválasztott Arabidopsis felülúszó UV-abszorpciós profilját bemutató kromatogram. Géltérfogat: 500 ml; oszlophossz: 700 mm; oszlopátmérő: 30 mm; eluens áramlási sebessége: 12 ml/óra; frakciótérfogat: 8,0 ml; frakciók száma: 95; mintatérfogat: 5 mL; elválasztási hőmérséklet: 4 °C; elúciós puffer: 20 mM Tris-HCl, 1 mM NaN3; pH 8,0. Képhitel: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Chrom_SephG-50.tif
Az elúció maga azért működik, mert megbontja az oszlop és a szubsztrát közötti kötéseket (pl. az eluens magas sótartalmával vagy magas hőmérsékletével). Az eluálás általában a minta tárolásával és további alkalmazásával kompatibilis kis mennyiségű pufferben történik.
A mini-prep oszlopról történő DNS-elúció a legegyszerűbb eset: egy térfogat puffer szinte az összes DNS-t eltávolítja. Az eluátumban lévő DNS koncentrációja fordítottan arányos a felhasznált elúciós pufferrel: minél több puffert használunk, annál kisebb a végső DNS-koncentráció. A legtöbb gyártó azonban még ebben az esetben is további egy térfogat használatát javasolja az összes DNS eltávolításához.
Az oszlopok esetében az elúciós sebesség kritikus. A túl lassú sebesség növeli a molekula lebomlásának esélyét; a túl gyors és nem lesz frakciófelbontás.
A nagy térfogatú oszlopok esetében az eluátumfrakciókat össze kell gyűjtenie, mert a molekulája eloszlik közöttük. Az első frakció a mosási és elúciós puffer keverékét és a mosási pufferrel el nem távolított esetleges szennyeződést fogja tartalmazni.
A molekula típusának OD-ját (260nm/280nm a DNS esetében) monitorozhatja, és blotot készíthet az egyes frakciókban lévő specifikus molekula koncentrációjáról. A legegyszerűbb esetben az Ön molekulájának eloszlása egy egyszerű haranggörbét követ, de lehet egy vagy több éles csúcs is.
Végeredményben, ha ismeri a kísérlet alapvető paramétereit (abszorbens, oszlop mérete, mosópuffer, elúciós puffer, áramlási sebesség, frakciók száma) és az elúció általános elveit, akkor sikeresen beállíthatja az elúciót.
A további részletekért keressen egy olyan cikket, ahol más tudósok valami hasonlót csináltak – ideális esetben ugyanazt a molekulát, de egy hasonló is megteszi -, és igazítsa az Ön körülményeihez
.
Vélemény, hozzászólás?