A HC-FIA rendszerben a szonda DNS-funkcionalizált FNP-k felerősítik a vírus RNS és a szondában lévő DNS hibridizációjának jelét. A HC-FIA bioszenzor tervezési elve az 1. ábrán látható.
a, A HC-FIA elve. b, Reprezentatív eredmények egy laterális áramlási csíkon. c, A fluoreszcens analízis eszköz. d, Fénykép a hordozható bőröndös laboratóriumról, amelynek hossza 55,5 cm, szélessége 37 cm és magassága 23 cm, súlya 8,5 kg. e, A HC-FIA vizsgálat vizsgálati folyamata. 1. lépés: nukleinsav hibridizáció inkubátorban, állandó hőmérsékleten. 2. lépés: a fluoreszcens jelek intenzitásának meghatározása a tesztkártyán a c. pontban látható eszközzel. f, A szonda eloszlása a SARS-CoV-2 genomjában.
A HC-FIA assay tervezése és működése
Az egér S9.6 monoklonális antitesteket az oldalsó áramlási csík tesztvonalára (T) előre rögzítjük, a kontrollvonalat (C) pedig kecske antinyúl IgG poliklonális antitestekkel vonjuk be (1a. ábra). Az S9.6 antitestekkel és nyúl IgG-vel jelölt FNP-ket a reakciócsőbe helyezzük. A kimutatási folyamat kezdetén a toroktamponban vagy köpetmintában lévő SARS-CoV-2 lizálódik és felszabadul, és a felszabaduló RNS hibridizálódik a specifikus SARS-CoV-2 DNS-szondával. A keletkező RNS-DNS hibridet az FNP-jelölt S9.6 antitestek befogják, és a komplex a mintalap és a nitrocellulózmembrán mentén a kapilláris erők hatására az abszorbens papír felé áramlik. A T területen áthaladva a komplexet az S9,6 antitestek befogják, fokozatosan fluoreszcens jelet generálva. A C területen az FNP-vel jelölt nyúl IgG-t az antinyúl IgG fogja be. A cél SARS-CoV-2 RNS jelenlétének vagy hiányának megállapítása a fluoreszcencia intenzitásának cut-off értéke alapján történik (1b,c ábra). Az 1d. ábra egy hordozható bőröndös laboratóriumot mutat, amely a következő két lépés: a hibridizáció és az immunfluoreszcencia-elemzés után kevesebb mint egy óra alatt képes minőségi eredményeket szolgáltatni (1e. ábra).
Itt a teszt fluoreszcenciajel és a kontroll fluoreszcenciajel arányát (T/C) használtuk az oldalsó áramlási csíkon úgy, hogy a tesztkártya esetleges háttérfluoreszcenciájának befolyását minimalizáltuk. 211 egészséges egyéntől származó toroktamponminták T/C arányának mérésével azt találtuk, hogy az átlagos háttér T/C arány 49,95 volt, 17,16-os s.d. mellett (1a. kiegészítő ábra). A receiver operating characteristic (ROC) görbét és a görbe alatti területet (AUC) használtuk a határérték meghatározására és a HC-FIA teszt diagnosztikai pontosságának értékelésére az érzékenység és a specificitás alapján különböző küszöbértékek mellett. 100 klinikailag megerősített és kizárt COVID-19-es esetből származó toroktamponminták felhasználásával 0,999-es AUC értékű ROC-görbét határoztunk meg 95 %-os konfidenciaintervallummal (CI) 0,997-1,000 között (1b. kiegészítő ábra). A legmagasabb érzékenységet és specificitást biztosító határértéket 102,07-ben határozták meg, ami 0,980-as Youden-indexpontnak felel meg. Alternatívaként a negatív háttérérték kétszeresének megfelelő küszöbértéket (itt 49,95 × 2 = 99,90) szokták használni határértékként az immunpróbáknál. Az egyszerűség kedvéért 100,00 T/C cut-off értéket választottunk
HC-FIA assay fejlesztése
A DNS-szondák optimalizálása a SARS-CoV-2 cél-RNS-szekvenciájához kulcsfontosságú a vizsgálat hatékonyságának javításához. Az általunk tervezett összes DNS-szondaszekvencia listáját az 1. kiegészítő táblázat tartalmazza. A SARS-CoV-2 genomja körülbelül 30 000 bázist tartalmaz, beleértve változó számú (6-11) nyitott olvasókeretet (ORF). Az első ORF a teljes genom mintegy 67%-át teszi ki, és 16 nem strukturális fehérjét, valamint segédfehérjéket és strukturális fehérjéket kódol. A négy fő strukturális fehérje a tüskeglikoprotein (S), a kis burokfehérje (E), a mátrixfehérje (M) és a nukleokapszidfehérje (N)15,16 . A SARS-CoV-2 legtöbb nukleinsav-kimutatási próbája a vírusgenom következő három konzervált régióját használja: ORF1ab, amelyben az RNS-függő polimeráz gén (rdrp) található15, valamint az N-t és az E-t kódoló régiók.
A SARS-CoV-2 RNS-genomszekvenciájának lekérdezésével kezdtük a National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBankból (hozzáférési számok: MN908947, MN908947.3, MN908947.2 és NC_045512.1). A SARS-CoV-2 genom egyéb közzétett szekvenciáinak részletes elemzése nem mutatott ki említésre méltó eltérést ezekben a régiókban. A Primer Premier 5.0 tervezőszoftver segítségével mindhárom régióhoz három szondát terveztünk: CoV01 és CoV04, amelyek az ORF1ab és N kimutatására ajánlott régióban találhatók; valamint CoV08, az E17-gyel azonos régióban. A szondák kötőhelyeinek genomi pozícióit a referencia genomszekvenciában (NC_045512.2) az 1f. ábra mutatja.
A tervezett DNS-szondák és az emberi genomból, valamint vírusok, baktériumok, mycoplasma, chlamydia és más gyakori kórokozók genomjából származó szekvenciák között szekvenciaillesztést végeztünk. A szondák csak a SARS-CoV-2 genomi szekvenciájának feleltek meg, és nem találtunk homológiát a humán genomi DNS-sel. Pozitív kontrollként a célgén különböző régióit hordozó álvírusokat használtunk, amelyeket lentivírusokkal mint vektorokkal konstruáltunk. A felhasznált pszeudovírusok célgén-szekvenciáit a 2. kiegészítő táblázat tartalmazza. A P1 pozitív volt a SARS-CoV-2 N régiójára, a P2 a SARS-CoV-2 E régiójára és a P3 a SARS-CoV-2 ORF1ab régiójára. A három pozitív kontroll koncentrációja 3000 transzdukciós egység (TU) ml-1 volt, ami azt jelenti, hogy 3000 fertőző vírusrészecske volt ml-ben. Az N1-N17 negatív kontrolljaként fiziológiás sóoldatot, tisztított vizet és más gyakori kórokozókra pozitív garatmintákat használtunk. A vizsgálatban használt pozitív és negatív referenciákról szóló információk listáját a 3. kiegészítő táblázat tartalmazza. A vizsgálati eredményeket a 4-6. kiegészítő táblázatok tartalmazzák. Az ORF1ab régióhoz a CoV01 és CoV03 szondákat választottuk; az E régióhoz a CoV08 szondát választottuk; az N régióhoz pedig a CoV04 és CoV06 szondák kötődtek előnyösen a cél-RNS-hez. A kiválasztott DNS-szondákat kombinációval tovább optimalizáltuk (7. kiegészítő táblázat), úgy, hogy a szondák minden csoportja egyszerre célozta meg mindhárom szegmenst. A 8. kiegészítő táblázatban szereplő HC-FIA vizsgálati eredmények azt mutatják, hogy a Cov01, Cov04 és Cov08 szondák kombinációja (2. csoport) megkülönböztette az összes pozitív kontrollmintát a negatív kontrolloktól, és alacsony vírustiterrel (1000 TU ml-1; 3. kiegészítő táblázat, L1-L3) rendelkező pozitív mintákat 95%-nál magasabb pozitív arányban mutatott ki. Ezért a 2. csoportot választottuk végleges kombinációnak. Eddig 13 411 SARS-CoV-2 nukleotidszekvenciát tettek közzé az NCBI-on. A három szonda és a 13 411 feltöltött szekvencia megfelelő célrégiójának összehangolása azt mutatta, hogy a szondák célrégiói elég konzerváltak ahhoz, hogy 100%-os hasonlóságot mutassanak.
A vizsgálat vizsgálati körülményeit is optimalizáltuk, különösen a hibridizáció inkubációs idejét és a tesztcsík leolvasási idejét. Az assay teljesítményét 10 perc, 20 perc, 30 perc, 40 perc, 50 perc és 60 perc inkubációs idő esetén 56 °C-on a 9. kiegészítő táblázat mutatja. Megjegyzendő, hogy 20 perc elegendő volt ahhoz, hogy a DNS-szondák hibridizálódjanak a célrégióval, amit az alacsony vírustiterű (1000 TU ml-1; 3. kiegészítő táblázat, L1-L3) pozitív toroktampon- és köpetminták kimutatásánál a 100%-os pozitív arány is tükrözött. Amikor az inkubációs időt 50 vagy 60 percre hosszabbítottuk, a reakció nem volt olyan stabil, mivel az L1-L3 referenciaminták pozitív aránya csökkent. Figyelembe véve a kimutatási hatékonyságot és a vírus inaktiválásának követelményét, 30 percet választottunk a hibridizáció 56 °C-on történő inkubációs idejének. A szalag leolvasási idejét a 10 perc, 12 perc, 15 perc és 18 perc értékekre is értékeltük (10. kiegészítő táblázat). Az eredmények azt mutatták, hogy 12 perc vagy ennél hosszabb idő vezetett a pozitív és negatív referenciaminták helyes kimutatásához. A variációs együttható (CV) azonban csak 15 perces leolvasási idő alkalmazásakor volt 10%-nál alacsonyabb az alacsony vírustiterű pozitív minták kimutatásánál. Ezért 15 perc leolvasási időt választottunk.
A minták tartósítására szolgáló transzportközegként a guanidinium-tiocianátot és a guanidin-kloridot – a nukleinsav extrakcióhoz leggyakrabban használt fehérje denaturálószereket – hasonlítottuk össze. A guanidinium-tiocianát jobb teljesítményt mutatott a pozitív és negatív minták megkülönböztetésében, viszonylag alacsony CV-vel az alacsony vírustiterű minták esetében. Valójában a guanidinium-tiocianát akár 6 mol l-1 koncentrációban is kiváló vírusellenes tulajdonságokat mutatott18. A transzportközegben történő vírusinaktiváláshoz 5 mol l-1 koncentrációjú guanidinium-tiocianátot választottunk fehérje denaturálószerként.
A HC-FIA-teszt specifikussága
A szondaszekvenciák és a reakciókörülmények optimalizálása után megvizsgáltuk a HC-FIA-teszt specifikusságát a SARS-CoV-2 kimutatására. A pozitív kontrollok célgénekkel rendelkező álvírusokat (P1-P3 minták) és öt klinikai toroktamponmintát (P4-P8 minták) tartalmaztak, amelyeket RT-qPCR-alapú nukleinsav-detektáló kit (Shanghai ZJ Bio-Tech) segítségével igazoltunk. A negatív kontrollok, amelyek toroktamponmintákból álltak, SARS-CoV-2-re negatívnak, influenza A, influenza B, légúti szinciális vírus, chlamydia pneumoniae, adenovírus vagy más kórokozókra pozitívnak (N5-N17 minták), illetve MERS N régiójára (N18 minta) vagy SARS-ra (N19 minta) pszeudovírus-pozitívnak bizonyultak. Az összes minta listáját a 3. kiegészítő táblázat tartalmazza. A 8 pozitív referencia minta és a 15 negatív referencia minta kimutatási eredményeinek listáját a 11. kiegészítő táblázat tartalmazza.
Vizsgáltuk, hogy van-e keresztreaktivitás a SARS-CoV-2 és 55 gyakori, légúti betegségeket okozó kórokozó között. Az egyes patogén mikroorganizmusok forrását és mennyiségi adatait az 1. kiegészítő adatkészlet tartalmazza. Az eredeti vírustitert 106 plakkképző egység/ml értékben határoztuk meg plakkvizsgálat segítségével. A baktériumok, a mycoplasma és a chlamydia interferencia-mintái esetében a koncentrációs szint 107 kolóniaképző egység/ml volt. Ezenkívül három teljes vérmintából humán genomi DNS-t extraháltak és számszerűsítettek 90-105 µg ml-1 értékben. A HC-FIA-teszt kiváló specificitást mutatott a SARS-CoV-2-re, és nem mutatott nyilvánvaló keresztreaktivitást az összes többi kórokozó mintával és humán genomi DNS-sel (Kiegészítő adatkészlet 1).
Mivel az S9.6 monoklonális antitest az RNS-RNS-duplexekhez19 is kötődik, különösen az AU-ban gazdagokhoz20 , ezért különböző AU-frakciókat tartalmazó kettősszálú RNS-szekvenciákat terveztünk. A részletes szekvenciainformációkat a 12. kiegészítő táblázat tartalmazza. Amint az a 13. kiegészítő táblázatban látható, a HC-FIA-teszt az AU-tartalomtól függetlenül nem mutatott kimutatható pozitív jelet a kettős szálú RNS-szel szemben, ami azt jelzi, hogy az S9.6 antitest és a kettős szálú RNS között a vizsgálati körülmények között alacsony a kötési affinitás. Azt is megvizsgáltuk, hogy a kettős szálú RNS jelenléte befolyásolja-e az assay teljesítményét klinikai torokkenet- vagy köpetminták kimutatásában. 2 pozitív toroktamponmintát, 2 pozitív köpetmintát, 10 negatív toroktamponmintát és 5 negatív köpetmintát használtunk. Megmértük a T/C arányokat az interferenciamentes teszt T/C értékeihez viszonyítva, és megállapítottuk, hogy az arányok 0,9 és 1,1 között mozogtak (1. kiegészítő adatkészlet). Ez azt jelzi, hogy a kettős szálú RNS jelenléte, függetlenül az AU-tartalomtól, nem befolyásolja jelentősen a HC-FIA-teszt teljesítményét.
A HC-FIA-teszt érzékenysége és pontossága
A célgének három szakaszát tartalmazó pszeudovírus-mintákat sorozatosan 5000, 2500, 1500, 1000, 800, 500, 500, 250 és 100 TU ml-1 titerre hígítottuk, és kiszámítottuk a 20 párhuzamos teszt átlagos T/C értékeit. A 2a. ábra azt mutatja, hogy a SARS-CoV-2 N, E vagy ORF1ab régiójára pozitív pszeudovírus kimutatási határértéke (LOD) mindössze 1000 TU ml-1 volt, 95%-nál nagyobb pozitív arány mellett. Amikor az álvírus-minták titerei elérték a 108 TU ml-1 értéket, nem volt észlelhető horoghatás (2. kiegészítő ábra). Az assay lineáris tartománya 103 és 106 vagy 107 TU ml-1 közötti titereknek felel meg.
A függőleges tengelyek a tesztjel (T) és a kontrolljel (C) fluoreszcencia-intenzitás arányát (T/C) mutatják. Minden koncentráció esetében 20 vizsgálatot végeztünk párhuzamosan. A LOD-t úgy határoztuk meg, mint azt a koncentrációt, amelynél a pozitív arány nagyobb vagy egyenlő 95%-kal. a, T/C arányok a SARS-CoV-2 N, E és ORF1ab régiójára pozitív, sorozatosan hígított pszeudovírus mintákhoz. b, T/C arányok három kritikusan beteg betegtől származó, sorozatosan hígított toroktamponmintákhoz. Az adatok átlag ± s.d.
Három kritikusan beteg betegtől származó toroktamponmintákat – akikről RT-qPCR segítségével megállapították, hogy SARS-CoV-2-pozitívak, és a vírusterhelést digitális PCR segítségével számszerűsítették – negatív toroktamponmintákkal kevertük össze, hogy 2000, 1000, 1000, 500, 400 és 250 kópia/ml sorozathígításokat készítsünk. Amint a 2b. ábrán látható, az LOD 500 kópia/ml volt, 95% feletti pozitív arány mellett. A LOD ellenőrzésére olyan klinikai toroktamponmintákat használtunk, amelyek T/C értéke közel volt a pozitivitás kritikus értékéhez (100) (a digitális PCR szerint az ORF1ab régió 512, 489 és 497 kópiáját ml-ben tartalmazó minták) (a vizsgálatokat 20-szor párhuzamosan végeztük el). Ezeknek a mintáknak a pozitív aránya meghaladta a 95%-ot (14-16. kiegészítő táblázat).
A HC-FIA kit pontosságának értékeléséhez minden egyes klinikai toroktamponmintán 20 alkalommal végeztünk párhuzamos teszteket öt egymást követő napon. A kiválasztott reprezentatív klinikai minták egy pozitív minta (1348 kópia/ml az ORF1ab régióból), egy kritikusan beteg személytől származó minta (kritikus; 512 kópia/ml) és egy negatív minta (0 kópia/ml) voltak. A három tétel átlagos T/C értékei a pozitív minta kimutatásakor a következők voltak: 199,92 ± 8,25 (CV = 4,13%), 200,68 ± 7,91 (CV = 3,94%), illetve 199,03 ± 7,43 (CV = 3,73%), szemben a 109,17 ± 5,68 (CV = 4,65%), 110,80 ± 5,68 (CV = 4,65%), 110,80 ± 5,43 (CV = 3,73%) és 200,68 ± 7,91 (CV = 3,94%) értékekkel.63 (CV = 5,08%) és 111,48 ± 4,67 (CV = 4,19%) a kritikus minta esetében, valamint 44,66 ± 3,36 (CV = 7,52%), 43,99 ± 2,72 (CV = 6,18%) és 44,72 ± 2,98 (CV = 6,18%) a kritikus minta esetében.66%) a negatív minta esetében. A tételek közötti CV-értékek 3,89%, 4,66% és 6,74% voltak. A vizsgálat tehát jó pontosságot és reprodukálhatóságot mutatott a SARS-CoV-2 kimutatására.
A HC-FIA vizsgálat robusztussága
A HC-FIA robusztusságának megismerése érdekében értékeltük az endogén interferenciaanyagok (például hemoglobin és mucin) és az exogén interferenciaanyagok (különösen a légúti fertőzésben szenvedő betegek kezelésében gyakran használt klinikai gyógyszerek, köztük vírusellenes gyógyszerek, antibiotikumok és hormonok) hatását. A kísérlethez 18 klinikai toroktamponmintát használtunk, köztük hat kritikus mintát (500-530 kópia/ml az ORF1ab régióra vonatkozóan a digitális PCR szerint), hat negatív és hat pozitív mintát. Az eredményeket a T/C értékek arányaként is rögzítettük (interferenciaminták kontra kontrollminták). Az elkészített interferenciamintákban a hemoglobin koncentrációja 0,5 g l-1, 1,0 g l-1 és 2,0 g l-1, a mucin koncentrációja pedig 5 g l-1, 10 g l-1 és 20 g l-1 volt. Az exogén interferenciaminták gyógyszerkoncentrációi (17-19. kiegészítő táblázatok) jóval magasabbak voltak, mint a plazma csúcskoncentrációik in vivo. A várakozásoknak megfelelően az összes T/C arány a 0,9-1,1 tartományban volt (2. kiegészítő adatkészlet), ami azt jelzi, hogy a HC-FIA-mérés ellenálló az interferenciával szemben.
A HC-FIA tesztkészlet klinikai értékelése
A HC-FIA tesztkészlet teljesítményének további értékelése érdekében randomizált, kettős vak klinikai vizsgálatot végeztek, amelyben a tesztet RT-qPCR-rel (a Shanghai ZJ Bio-Tech által gyártott és az NMPA által jóváhagyott SARS-CoV-2-detektáló készlet) vagy a klinikai diagnózis eredményeivel hasonlították össze három független egészségügyi intézményben. A klinikai értékelés során használt HC-FIA tesztkészlet tesztkártyákat, lízispuffert, mintakonzerváló oldatot, pozitív és negatív kontrollokat, valamint DNS-szondákat és jelölt antitesteket tartalmazó reakciócsövet tartalmazott. A megerősített vagy kizárt COVID-19-es esetek klinikai diagnózisának eredményei, amelyeket a kijelölt kórházak bocsátottak rendelkezésre, a komputertomográfiás felvételeken és a betegek klinikai manifesztációin alapultak, ahogyan azt a “Diagnosis and Treatment Protocol for Novel Coronavirus Pneumonia (Trial Version 6.0)” kínai útmutatója előírja. Összesen 734 mintát (593 toroktampon és 141 köpet) vizsgáltak párhuzamosan 670 személytől. A klinikai vizsgálatok nyers adatait a 3. kiegészítő adatkészlet tartalmazza. Az általunk használt RT-qPCR detektáló kitet három célpontos (ORF, N és E) rendszerként terveztük, és a pozitív és negatív minták megkülönböztetésére a teszt-reteszt elvét követtük. Az érvénytelen belső standard okozta négy sikertelen teszt mellett nyolc újratesztelést végeztünk: egyet azért, mert csak az egyik célzott rdrp gén volt pozitív, és hetet azért, mert csak az N és E gének voltak pozitívak. Ezekben az esetekben a korábbi negatív eredményeket kizárták.
A vizsgálatba bevont 670 beteg közül 313 férfi (46,72%) és 357 nő (53,28%) volt. Amint a 3. kiegészítő ábra mutatja, a beiratkozott populáció életkori megoszlása hasonló a SARS-CoV-2 fertőzés életkori megoszlásához21. A látogatási arány és a diagnózisok aránya szintén kiegyensúlyozott volt. A HC-FIA tesztkészletek eredményeit a 3. ábra mutatja, amely a fluoreszcens fényforrás alatti tipikus eredmények fényképeit és a megfelelő gradiens színmátrixot mutatja a leolvasás normalizálása után. A 4. kiegészítő ábrán látható gradiens színmátrix 734 klinikai minta normalizált fluoreszcencia-leolvasását mutatja (3. kiegészítő adatkészlet).
Fotók tipikus eredményekről fluoreszcens fényforrás alatt, és a megfelelő fluoreszcencia-leolvasások szín-gradiens mátrixként, a maximális leolvasási értékre normalizálva. Az E csoport csak COVID-19-negatív eredményeket tartalmaz. A színsáv vízszintes vonala jelzi a határértéket. A 734 klinikai minta fluoreszcencia-leolvasásainak szín-gradiens mátrixát a 4. kiegészítő ábra, a megfelelő numerikus adatokat pedig a 3. kiegészítő adatkészlet tartalmazza.
621 eset esetében a HC-FIA eredmények és a klinikai diagnózisok összhangban voltak (210 megerősített és 411 kizárt eset; 1. táblázat); 49 eset (27 megerősített és 22 kizárt klinikai diagnózis alapján) nem felelt meg a HC-FIA eredményeknek. 730 minta esetében a HC-FIA-vizsgálat eredményei összhangban voltak az RT-qPCR-rel (249 pozitív és 481 negatív; 1. táblázat). Négy olyan minta, amely az RT-qPCR alapján negatív volt, a HC-FIA segítségével pozitív lett. E minták közül három olyan betegektől származott, akiket klinikailag COVID-19-kizártnak diagnosztizáltak, ami azt jelzi, hogy a HC-FIA teszt hamis pozitív eredményt adott. A fennmaradó minta klinikai diagnózis alapján megerősített esetnek felelt meg, ami összhangban volt a HC-FIA-teszttel.
A Cohen-kappa (κ), amely a kategorikus változók közötti egyezés megbízhatóságának gyakran használt mérőszáma, a változók közötti egyszerű százalékos egyezéshez képest robusztusabb mérőszám, mivel a κ figyelembe veszi a véletlenszerűen előforduló egyezéseket is, különösen kiegyensúlyozatlan adathalmazok esetén. Úgy tekintettük, hogy a 0,75-nél nagyobb κ érték magas szintű egyezést jelez (a tökéletes egyezés κ = 1 értéknek felel meg). Amint az a 2. táblázatban látható, a HC-FIA teszt eredményei magas szintű egyezést mutattak a klinikai diagnózissal (κ = 0,8393) és az RT-qPCR-rel (κ > 0,98, a mintatípustól függetlenül).
Vélemény, hozzászólás?