Materials

Duloxetine (DLX) pure grade was graciously provided as gift samples by Lupin Pharmaceuticals, Mumbai, India. A 100 M, 4CM és 15 M CR minőségű hidroxipropil-metilcellulóz (HPMC) minőségeket a Panacea Biotech Limited, R&D Center, Lalru, Punjab, India nagylelkűen biztosította. A vizsgálatban használt összes többi laboratóriumi vegyszer és reagens analitikai reagens minőségű volt. A vizsgálat során végig kétszer desztillált vizet használtunk. A 400-as polietilén-glikolt a S.D. Fine Chem Ltd., Boisar, India cégtől vásároltuk. A dinátrium-hidrogén-foszfátot, a kálium-dihidrogén-foszfátot és a nátrium-hidroxidot a CDH Ltd.-től (Újdelhi, India) vásároltuk. Az abszolút etanolt a Changshu Yangyuan Chemical-től (Kína) szereztük be. Az n-oktanolt az E-Merck (India) Ltd-től (Mumbai, India) vásároltuk. A dialízismembrán150 a Hi Media Laboratories Ltd., Mumbai-tól származik. Minden anyagot és port vákuumban, szobahőmérsékleten tároltunk.

Készülékek

Az UV spektrumokat Perkin Elmer lambda 15 UV/látható spektrofotométeren vettük fel az UV/látható tartományban 190-600 nm között. A Franz-diffúziós cellaszerelvényt az amerikai Permegear, Inc. cégtől szereztük be. Az FT-IR-8300 infravörös spektrofotométert a Perkin Elmer PE RX 1 FTIR spektrofotométertől szereztük be. A differenciál pásztázó kalorimetriás (DSC) spektrumokat a DSC Q20 V24.2 Build 107 modell (Universal V4.5A TA Instruments) segítségével nyertük. A kutatócentrifuga a REMI Equipments, Mumbai, India cégtől származott. A CyberScan pH 510 pH-mérőt az Eutech Instruments, India cégtől szereztük be.

Preformulációs vizsgálatok

Foszfátpufferes sóoldat pH 7 előállítása.4

0,19 g kálium-dihidrogén-foszfátot, 2,38 g dinátrium-hidrogén-ortofoszfátot és 8,0 g NaCl-t oldottunk desztillált vízben, majd a térfogatot 1000 ml-re egészítettük ki desztillált vízzel. A puffer pH-értékét 7,4-re állítottuk be.

Duloxetin-hidroklorid mennyiségi meghatározása

A duloxetin-tartalmat UV-spektrofotometriás elemzéssel vizsgáltuk foszfátpufferes sóoldatban pH 7,4. A törzsoldat pásztázását a 190-400 nm-es UV-tartományban végeztük. A λ max-ot 289 nm hullámhosszon kaptuk. A duloxetin-hidroklorid A törzsoldatát (250 μ/ml) 0,0250 g hatóanyag foszfátpufferes sóoldatban (pH 7,4) 100 ml-re történő feloldásával készítettük. A továbbiakban a duloxetin 1 μg/ml-től 100 μg/ml-ig terjedő sorozatos hígításait az A és B törzsoldatok foszfátpufferrel (pH 7,4) történő hígításával készítettük. A hígítások abszorbanciaértékeit a DLX λ max értékénél jegyeztük fel, azaz, 289 nm-en a vakpróbának vett foszfát pufferelt sóoldattal (pH 7,4) szemben, és kalibrációs görbét rajzoltunk.

Duloxetin-hidroklorid fizikai-kémiai jellemzése

Az olvadáspont meghatározása

Kis mennyiségű duloxetin-hidrokloridot vettünk kapilláris csőbe (az egyik végén összeolvasztva) és olvadáspontmérő készülékbe helyeztük, majd az olvadási hőmérsékletet rögzítettük. Ehhez három különálló mérést végeztünk, és ezek átlagértékét kaptuk meg.

A megoszlási együttható meghatározása

A duloxetin-hidroklorid megoszlási együtthatóját oktanol-víz rendszerben határoztuk meg (Wells 2002). A két fázist 1:1 v/v arányban vettük és kölcsönösen telítettük 37 °C-on vízfürdőben rázógépen, majd a két fázist elválasztottuk. Tíz milligramm hatóanyagot adtunk 20 ml előtelített szerves fázis és 20 ml előtelített víz keverékéhez, majd 10 percig rázogattuk. A lombikokat ezután 24 órán keresztül 37 °C-on tartottuk, időszakos rázással. Ezt követően az elegyet centrifugáltuk a vizes és a nem vizes fázisok szétválasztása érdekében. A két fázist külön-külön spektrofotometriásan elemeztük duloxetinre. Ezután a hatóanyag “K o/w” megoszlási együtthatóját az oktanolos és a vizes fázisban lévő hatóanyag-koncentráció arányából számoltuk ki.

A gyógyszer-polimer kölcsönhatási vizsgálatok

Fourier-transzformációs infravörös spektroszkópia

A tiszta hatóanyag DLX, a DLX és HPMC fizikai keveréke (15 CR, 100 M és 4 M), valamint a hatóanyaggal töltött transzdermális tapaszok elemzésére a KBr pellet módszer alkalmazásával Fourier-transzformációs infravörös spektroszkópiát (FTIR) alkalmaztunk. Minden mintát 400 és 4000 cm-1 között pásztáztunk.

Differenciális pásztázó kalorimetria

A gyógyszer és a felhasznált polimer közötti lehetséges kölcsönhatásokat a tiszta duloxetin-hidroklorid hatóanyag és a készítmény (HPMC + hatóanyag) DSC termogramjaiból elemeztük, amelyeket a DSC modell Q20 V24.2 Build 107 (Universal V4.5A TA Instruments) segítségével nyertünk. Minden mintát lapos aljú alumínium edénybe zártunk, és 25 és 300 °C közötti hőmérséklet-tartományban 5 °C/perc növekedési sebességgel melegítettük.

Transzdermális tapaszok előállítása

A duloxetin-hidrokloridot tartalmazó transzdermális filmeket oldószeres párologtatásos módszerrel öntöttük üveglemezre különböző minőségű (K 15 M CR, K 4CM, K 100 M) HPMC felhasználásával, lágyítószer jelenlétében és hiányában. Lágyítószerként minden esetben PEG 400-at (5%) használtunk. Az 1. táblázat a különböző típusú formulázott tapaszok képletét és összetételét mutatja. A duloxetin-hidrokloridot (60 mg) víz-metanol oldószerkeverékben (7:3) oldottuk. A gyógyszermátrixot HPMC különböző koncentrációinak (1% és 1,5% w/v) ugyanabban az oldószerrendszerben történő feloldásával állítottuk elő. Az oldatot 24 órán át háborítatlanul tartottuk, majd fecskendő és tű segítségével az oldatot az üvegfelületre helyezett 5,0 cm átmérőjű üveggyűrűbe öntöttük. Az oldószert 6 órán át hagytuk elpárologni 60 °C-os termosztatikusan szabályozott kemencében. A tapaszokat a felhasználás előtt 7 napig légmentesen lezárt tartályban, környezeti körülmények között tároltuk.

1. táblázat A duloxetin HCl formulázott transzdermális rendszereinek képletei és összetétele

A transzdermális tapaszok értékelése

Fizikai megjelenés

Az elkészített tapaszokat vizuálisan megvizsgáltuk szín, tisztaság, rugalmasság és simaság szempontjából.

A tapasz vastagsága

A hatóanyaggal töltött tapaszok vastagságát csavaros mikrométerrel mértük a tapaszok három különböző pontján. A három leolvasás átlagértékeit és a standard eltérés értékeit minden egyes hatóanyaggal töltött tapaszra vonatkozóan kiszámítottuk.

Súlyegyenletesség

A tapaszokat súlyváltozási vizsgálatnak vetettük alá az összes tapasz digitális mérleggel történő mérlegelésével. A meghatározásokat minden egyes készítmény esetében három példányban végeztük el. Ezután kiszámították az átlagos tömeg- és szórásértékeket.

Lapossági vizsgálat

A lapossági vizsgálatot annak felmérésére végezték, hogy az elkészített transzdermális tapaszok sima felülettel rendelkeznek-e és nem szűkülnek-e össze idővel. A fóliából három különböző részen három hosszanti csíkot vágtak ki. Minden egyes csík hosszát megmértük, és a síkosság egyenetlensége miatti hosszváltozást a százalékos szűkület meghatározásával állapítottuk meg, ahol a 0%-os szűkület 100%-os síkosságnak felel meg. A százalékos szűkületet a következőképpen kaptuk meg: (l 1 – l 2)/l 1 × 100. Itt l 1 az egyes csíkok kezdeti hossza, l 2 pedig az egyes csíkok végső hossza.

Hajtogathatósági állóképesség

Ezt a vizsgálatot a lágyítószer hatékonyságának és a különböző polimerek felhasználásával készített tapasz szilárdságának ellenőrzésére végeztük. A hajtásállóságot úgy határozzuk meg, hogy hány hajtás szükséges bármely polimer folt eltöréséhez. A hajtásállóságot kézzel mértük úgy, hogy a fólia egy kis csíkját (2 × 2 cm) ugyanazon a helyen többször hajtogattuk, amíg el nem szakadt. A hajtogatási kitartás értékét az adta meg, hogy hányszor lehetett a foltot ugyanazon a helyen törés/repedés nélkül összehajtani. Minden típusból három foltot vettek a vizsgálathoz.

Paraméteres nedvességfelvétel/vízgőzfelvétel

A százalékos nedvességfelvétel vizsgálatát a fóliák fizikai stabilitásának és integritásának ellenőrzésére végezték magas páratartalmú körülmények között. Az elkészített filmeket (3,14 cm2 ) egyenként pontosan lemértük, és szobahőmérsékleten 100 ml kálium-klorid telített oldatát tartalmazó exszikkátorban 85 ± 5% relatív páratartalomnak tettük ki. Ez idő alatt a filmeket rendszeres időközönként, 24, 48 és 72 óránként megmértük. A százalékos nedvességfelvételt a következő képlet alapján határoztuk meg:

Percens nedvességtartalom

Ezt a vizsgálatot a filmek integritásának ellenőrzésére is elvégeztük száraz körülmények között. Az egyes (meghatározott felületű) transzdermális filmeket olvasztott vízmentes kalcium-kloridot tartalmazó exszikkátorban tartottuk szobahőmérsékleten. Ez idő alatt a filmeket rendszeres időközönként, 24, 48 és 72 óra elteltével megmértük. A százalékos nedvességtartalmat a következő képlet segítségével határoztuk meg:

Vízgőz-transzmisszió

A vízgőz-transzmisszió (WVTR) a film egységnyi felületén egységnyi idő alatt áteresztett nedvesség mennyiségeként van meghatározva. Átviteli cellaként azonos térfogatú és átmérőjű üvegpalackokat használtunk. A küvettákat megfelelően mostuk és kemencében szárítottuk. Ezután minden egyes fiolába kb. 1 g vízmentes olvasztott kalcium-kloridot helyeztünk, és a tapaszt ragasztószalag segítségével rögzítettük az üveg peremén. Az üvegeket ezután megmértük, és 84%-os relatív páratartalom fenntartása érdekében telített kálium-klorid-oldatot tartalmazó exszikkátorokba helyeztük. A sejteket kivettük az exszikkátorokból, és az 1., 2., 3., 4., 5., 6. és 7. nap után megmértük. A vízgőz áteresztési sebességet a következőképpen határoztuk meg:

$$ W.\ V.\ T. = WL/S $$

Hol W az áteresztett vízgőzök tömege, L a tapasz vastagsága és S a kitett felület négyzetcentiméterben.

A felület pH-ja

A foltokat üvegcsövekben 1 órán keresztül 0,5 ml kétszer desztillált vízzel tartottuk érintkezésben, majd hagytuk megduzzadni. Egy kombinált üvegelektródot vittünk a tapasz felületének közelébe, és 1 perc kiegyenlítődési időt követően pH-méréseket végeztünk.

A hatóanyagtartalom meghatározása

Minden készítménytípusból 2 × 2 méretű darabokat vágtunk, és 100 ml foszfátpufferes sóoldat pH 7,4-es oldatába helyeztük. A tartalmat 2 órán át mágnesesen kevertettük, majd az oldatot Whatman szűrőpapíron (0,45 μ) átszűrtük, és megfelelően hígítottuk foszfátpufferes sóoldattal pH 7,4 pH-értékkel. Ezután az oldatot 289 nm-en vizsgáltuk az abszorbanciára, placebó tapasz vakpróbaként történő felhasználásával. Az abszorbanciaértékekből határoztuk meg a hatóanyagtartalmat.

In vitro hatóanyag-felszabadulás

A transzdermális készítmények in vitro jellemzésére Franz-féle diffúziós cellát alkalmaztunk. Ez egy megbízható módszer a topikális készítmények bőrön keresztüli hatóanyag-transzportjának előrejelzésére. A diffúziós cella receptorrekeszét 30,0 ml foszfátpufferelt sóoldattal (pH 7,4) töltötték fel, és szintetikus celofán membránnal in vitro hatóanyag-felszabadulási vizsgálatokat végeztek. Az elkészített készítményeket a donorkompartmentben lévő membránra vittük fel, és egyenletesen szétterítettük a celofánmembránon. A szerelvényt folyamatosan 37,0 ± 2,0 °C-on, 50 fordulat/perc fordulatszámon tartottuk. Ezután megfelelő időközönként (0, 0,5, 1, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 6, 12 és 24 óra) mintákat (1,0 ml-es aliquotákat) vettünk, és olyan mennyiségű tápfolyadékkal egészítettük ki, hogy a receptorfázis térfogata 30 ml legyen. A mintákat 289 nm-en spektrofotometriásan elemeztük.

A gyógyszerpermeáció/ex vivo vizsgálatok

A gyógyszerpermeációs vizsgálatokat hím Wistar patkányok bőrén végeztük. A patkányokat gerincferdüléssel áldozták fel. A bőrmintákat felvágták, eltávolították és normál sóoldattal mosták. A tapadó zsír- és kötőszövetet tompa végű csipesszel távolítottuk el. A bőrt 6 órán át normál sóoldatban tartottuk. A patkányok bőréről a szőrszálakat óvatosan leborotváltuk, hogy elkerüljük a perifériás károsodást. A Franz-diffúziós cella receptorrekeszét 30 ml foszfátpufferelt sóoldattal (pH 7,4) töltöttük fel. Az elkészített készítményeket a donorrekeszben lévő patkány bőrére vittük fel. A szerelvény hőmérsékletét folyamatosan 37 ± 2 °C-on tartottuk, a keverési sebességet pedig 50 rpm-en szabályoztuk. A mintákat (5 ml-es aliquotákat) megfelelő időközönként (0,5, 1, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 és 24 óra) vettük le, és ugyanolyan mennyiségű közeggel helyettesítettük, hogy a receptorfázis térfogata 30 ml maradjon. A mintákat spektrofotometriásan elemeztük a 289 nm-es λ max értéken.

Bőrirritációs vizsgálatok

A kísérleti állatok kezeléséhez etikai engedélyt kaptunk a Panjab University, Chandigarh intézményi etikai bizottságától (IAEC), és a vizsgálatokat a jóváhagyott protokoll szerint végeztük.

Az albínó Wistar patkányokat ketrecben tartottuk, a standard laboratóriumi takarmány és víz szabadon állt rendelkezésre. A patkányok háti hasi bőrét a vizsgálat elvégzése előtt 24 órával gondosan leborotválták, elkerülve a perifériás sérüléseket. A transzdermális tapaszt a meztelen bőrre helyezték, és nem érzékenyítő mikroporózus szalaggal fedték le. Standard bőrirritáló anyagként 0,8%-os v/v vizes formalinoldatot alkalmaztunk. Az állatokra 7 napig minden nap új tapasz került. A készítményt 7 nap elteltével eltávolították; az erythema pontszámát feljegyezték és összehasonlították a standarddal. Az erythema pontszámát a Draize-féle pontozási módszerrel (Draize et al. 1944) olvastuk le és rögzítettük: 0 pont, ha nincs erythema, 1 pont, ha nagyon enyhe erythema (világos rózsaszín), 2 pont, ha jól körülhatárolt erythema (sötét rózsaszín), 3 pont, ha mérsékelt vagy súlyos erythema (világos vörös), és 4 pont, ha súlyos erythema (sötét vörös).

Adatelemzés

Az n-edik minta esetében V s a levett minta térfogata, V t a befogadó közeg teljes térfogata, C c a korrigált koncentráció, C u az n-edik minta korrigálatlan koncentrációja és C i a korrigálatlan koncentráció. Továbbá a korrigált koncentrációt használtuk a felszabaduló hatóanyag mennyiségének és a felszabaduló hatóanyag százalékos arányának értékének kiszámításához az egyes mintavételi időpontokban, a hatóanyag felszabadulási sebességgel együtt.

A permeabilitási együttható a hatóanyag membránon/bőrön való áthaladásának sebessége μg/cm2/h-ban. A permeabilitási együtthatót a szállított hatóanyag százalékos aránya az idő függvényében készült grafikon meredekségéből számoltuk ki a következőképpen: P = meredekség × V d/S

Itt V d a donoroldat térfogata milliliterben, S pedig a szövet felülete négyzetcentiméterben.

A fluxust (J érték) az egységnyi keresztmetszetű akadályon egységnyi idő alatt átáramló anyagmennyiségként határozzuk meg. Számítása: