Doxycycline Is Anti-Inflammatory and Inhibits Staphylococcal Exotoxin-Induced Cytokines and Chemokines

A sztaphylococcus toxikus sokk szindróma toxin 1 (TSST-1) és a szerkezetileg rokon exotoxinok bakteriális exotoxinok, amelyek közvetlenül kötődnek az antigénprezentáló sejtek II. osztályú fő hisztokompatibilitási komplex molekuláihoz (1, 5, 8, 18, 23) és aktiválják a specifikus Vβ elemeket kifejező T sejteket (7). Ezeket a toxinokat szuperantigéneknek nevezik, mivel képesek poliklonálisan stimulálni a T-sejtek nagy populációit (1, 4, 7, 14). Így a staphylococcus exotoxinok (SE) az immunrendszer erős aktivátorai, és számos betegséget okoznak az emberben, beleértve az ételmérgezést, a toxikus sokkot és az autoimmun betegségeket (1, 2, 6, 12, 14, 22). Az immunrendszer sejtjeivel való kölcsönhatásuk proinflammatorikus citokinek és kemokinek tömeges termelődését eredményezi (1, 4, 15, 17). A tumor nekrózis faktor alfa (TNF-α), az interleukin-1 (IL-1) és a gamma interferon (IFN-γ) citokinek kulcsfontosságú közvetítői a szuperantigén által kiváltott toxikus sokknak (1, 21). Mind a TNF-α, mind az IL-1 erős immunstimuláló hatással rendelkezik, és az IFN-γ-vel szinergikusan hatva fokozza az immunreakciókat és elősegíti a szöveti károsodást (16). Következésképpen ezek a citokinek in vivo nagy koncentrációban patogén hatásúak, és felelősek az SE által kiváltott lázért és toxikus sokkért (13, 14, 18, 19).

A doxiciklin egy széles spektrumú antibiotikum, amelyet széles körben alkalmaznak mind a gram-negatív, mind a gram-pozitív mikroorganizmusok által okozott fertőzésekre. Bakteriosztatikumként hat, és rendkívül hatékony számos mikroorganizmus, többek között a Staphylococcus aureus, a Streptococcus pyogenes, a Bacillus anthracis és a Yersinia pestis ellen. A doxiciklin a tetraciklin antibiotikumok családjába tartozik, amelynek tagjai antimikrobiális hatásuktól független más biológiai hatásokkal is rendelkeznek (10). A doxiciklin gátolja a forbol-12-mirisztát-13-acetát által közvetített mátrix metalloproteináz 8 (MMP-8) és MMP-9 működését humán endotélsejtekben (11). A doxiciklin csökkenti az elasztin lebomlását és az MMP-aktivitást az aneurizmás betegség modelljében is (3). Nemrégiben kimutatták, hogy a doxiciklin a kortikoszteroidok által elérthez hasonló mértékben gátolja az IL-1β termelődését lipopoliszachariddal kezelt szaruhártya-hámtenyészetekben (25). In vivo a doxiciklin megvédte az egereket a halálos endotoxémiától azáltal, hogy csökkentette a citokin és nitrát szekréciót a vérben (20). Ebben a vizsgálatban a doxiciklin moduláló hatását vizsgáltuk a staphylococcus szuperantigén által kiváltott T-sejt-aktivációra és citokintermelésre humán perifériás vér mononukleáris sejtekből (PBMC).

A humán PBMC-t normál humán donorok heparinizált vérének Ficoll-Hypaque sűrűséggradiens centrifugálásával izoláltuk. A PBMC-ket (106/ml) 37°C-on tenyésztettük 24 lyukú lemezekben, amelyek RPMI 1640 tápfolyadékot és 10% hővel inaktivált magzati szarvasmarha szérumot tartalmaztak. A sejteket 16 órán keresztül SEB-vel (200 ng/ml) vagy TSST-1-gyel (200 ng/ml) inkubáltuk, majd a felülúszókat leszedtük és elemeztük IL-1β, TNF-α, IL-6, IFN-γ, MCP-1, MIP-1α és MIP-1β tekintetében. A citokineket és kemokineket enzimhez kötött immunoszorbens teszttel mértük citokin- vagy kemokin-specifikus antitestekkel a gyártó utasításainak megfelelően (15, 17). Humán rekombináns citokineket és kemokineket (20-1000 pg/ml) használtunk standardként a kalibráláshoz minden egyes lemezen. Az egyes vizsgálatok kimutatási határa 20 pg/ml volt. A citokin és kemokin adatokat a duplikált minták átlagértékeként ± a standard eltérés (SD) értékeként fejeztük ki. A doxiciklint, ha volt, a stimulálószerrel egyidejűleg adtuk hozzá. A citotoxicitást a laktát-dehidrogenáz (LDH) felszabadulásával mértük a citoszolból a tenyésztési felülúszóba. Az LDH mennyiségét a gyártó utasításai szerint kolorimetrikus citotoxicitási tesztkészlet (Boehringer Mannheim) segítségével határoztuk meg. A felszabaduló LDH maximális mennyiségét (100%) a sejtek 1%-os Triton X-100-mal történő lizálásával kaptuk. A T-sejtek proliferációját PBMC-vel (105/lyuk) vizsgáltuk, amelyeket három példányban SEB-vel vagy TSST-1-gyel (200 ng/ml), doxiciklinnel vagy anélkül, 48 órán keresztül 37°C-on 96 lyukú mikrotiterlemezekben telepítettünk. A sejteket a tenyésztés utolsó 5 órájában lyukanként 1 μCi timidinnel (New England Nuclear, Boston, Mass.) pulzáltuk a korábban leírtak szerint (15). A sejteket üvegszálas szűrőkre szedtük, és a beépült timidint folyékony szcintillációval mértük. Minden adatot a szignifikáns különbségek szempontjából Student’s t-teszttel elemeztünk a Stata (Stata Corp., College Station, Tex.) segítségével. A doxiciklinnel kezelt és a kezeletlen kontrollcsoportok közötti különbségeket akkor tekintettük szignifikánsnak, ha a P <0,05 volt.

Az alapján a jelentés alapján, hogy a doxiciklin blokkolta a lipopoliszacharid által indukált IL-1-et a hámsejtekben és megakadályozta a letális endotoxémiát in vivo (20, 25), azt a hipotézist teszteltük, hogy ennek az antibiotikumnak közvetlen hatása lehet az SE által indukált citokinekre. Amint az 1. ábrán látható, a doxiciklin dózisfüggően gátolta az IL-1β, IL-6, TNF-α és IFN-γ citokinek, valamint az MCP-1, MIP-1α és MIP-1β kemokinek termelését SEB-vel inkubált PBMC által. A citokinek és kemokinek doxiciklin általi hasonló dózisfüggő csökkenését figyeltük meg a TSST-1-stimulált PBMC esetében is (az adatok nem láthatóak). A doxiciklin SEB- vagy TSST-1-mediált citokinekre és kemokinekre gyakorolt gátló hatását, amelyet hét normál donorból származó PBMC-vel kaptunk, a 2. ábra foglalja össze. Az MCP-1 és az IFN-γ termelődését 50 μM doxiciklin teljesen blokkolta. Ez a doxiciklin-koncentráció az IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP-1α és MIP-1β mennyiségét a kezeletlen, SEB- vagy TSST-stimulált sejtekéhez képest 15-22%-ra, 37-41%-ra, 21-25%-ra, 10-15%-ra, illetve 59-61%-ra csökkentette. A TNF-β, ha jelen volt, szintén a kezeletlen, SEB-stimulált sejtekhez képest 25%-ra gátolták. A doxiciklin nem volt citotoxikus a PBMC-re ebben a koncentrációban, amit a trypan-kék kizárásával és a laktát-dehidrogenáz felszabadulásának hiányával mértek a kezelt sejtekből. E citokinek és kemokinek teljes gátlása a doxiciklin nagy dózisainál (>0,1 mM) volt megfigyelhető. A doxiciklin által okozott hasonló dózis-válasz gátlást figyeltek meg a SEB alacsonyabb koncentrációinál (1 és 10 ng/ml) (az adatok nem láthatóak).

Mivel a szuperantigének T-sejt proliferációt is okoznak, vizsgálták a doxiciklin hatását a SE által indukált T-sejt proliferációra. A 3. ábra azt mutatja, hogy a doxiciklin dózisfüggő módon gátolta a SEB- és TSST-1-stimulált T-sejt proliferációt, 0,05 mM-nél 98%-os gátlást ért el.

Ez a vizsgálat azt mutatta, hogy a doxiciklin hatékonyan gátolta a szuperantigének által közvetített citokinek és kemokinek termelését humán PBMC által in vitro. A staphylococcus szuperantigének által indukált T-sejt proliferációt is teljesen elnyomta. A proinflammatorikus citokinek és kemokinek doxiciklin általi downregulációja SEB- és TSST-1-stimulált PBMC-ben arra utalt, hogy a doxiciklin befolyásolhatja a toxikus sokk patofiziológiáját. Ezek az eredmények kiterjesztik más kutatók megfigyeléseit a doxiciklin antimikrobiális hatásán túlmenően immunmoduláló hatásáról.

A doxiciklin gyulladáscsökkentő hatásában több molekuláris mechanizmus, mind transzkripciós, mind poszttranszkripciós, is szerepet játszhat (11, 26). A proinflammatorikus citokinek elnyomása magában foglalhatja a PKC útvonal doxiciklin általi downregulációját, amint azt a granuloma kialakulására gyakorolt hatását vizsgáló tanulmány is sugallja (26). A doxiciklin bejelentett gátló dózisa (10-15 μM), amely in vitro csökkenti a kollagenázt, a zselatinázt és más metalloproteinázokat (10, 11), összehasonlítható az ebben a vizsgálatban használt dózissal, és többszöröse a humán szérumban a napi 200 mg szájon át történő adagolás után megfigyelt dózisnak (10, 24). Klinikai vizsgálatok azonban azt mutatják, hogy ez a dózis elegendő volt a kollagenáz és zselatináz aktivitás csökkentésére humán osteoarthritises porckivonatokban ex vivo (24). A doxiciklin szubantimikrobiális dózisáról (napi kétszer 20 mg) kimutatták, hogy gátolja az ínyfolyadék kollagenáz aktivitását (9). Ezenkívül kísérletes endotoxémiával végzett in vivo vizsgálatok szerint a doxiciklin és más tetraciklinek is hatásosak a gyulladásos citokinek szabályozásának csökkentésében és a sokk megelőzésében (20).

Végeredményben az itt bemutatott eredmények azt mutatják, hogy a doxiciklin csökkenti a proinflammatorikus citokinek és kemokinek szabályozását, ami a szuperantigén okozta toxikus sokk kezelésében való potenciális hasznosságára utal. Klinikai környezetben, amikor a gazdaszervezet több biológiai ágensnek van kitéve, beleértve a baktériumokat és a bakteriális exotoxinokat is, a doxiciklin alkalmazása további előnyt jelent, mivel antimikrobiális és gyulladáscsökkentő hatást egyaránt biztosít.