Az immunhisztokémia és a Western Blot összehasonlítása

By Sarah Moore, M.Sc.Reviewed by Michael Greenwood, M.Sc.

Az immunhisztokémia és a Western blotting egyaránt azon elv kihasználásával működik, hogy az antitestek specifikusan kötődnek a biológiai szövetekben lévő antigénekhez.

Képhitel: Sinitar/.com

Az immunhisztokémia a leggyakoribb immunfestési technika. Célzott antigének jelenlétét teszi láthatóvá egy szövetmintában olyan antitestek segítségével, amelyek katalitikus hatásuk révén az antigénekhez kapcsolódnak, és a molekulát azonosítható vegyületekre bontják. Ennek a kölcsönhatásnak a láthatóvá tétele enzim (kromogén jelet létrehozva) vagy fluorofór (fluoreszcens jelet létrehozva) alkalmazásával érhető el.

A Western blot ugyanezen az elven működik. Először az 1970-es években számoltak be róla, amikor a tudósok először használták a biológiai szövetekben létező különböző fehérjék sikeres osztályozására. Azóta jelentős előrelépések történtek a technológiában, ami a modern fluoreszcens, kolorimetrikus és kemilumineszcens Western blot technika kialakulásához vezetett.

A Western blot módszer minden változata az antigén-antitest komplex működésére támaszkodik a mintában jelen lévő specifikus fehérjék azonosítása érdekében, amelyeket vagy a kolorimetrikus, kemilumineszcens vagy fluoreszcens molekulák enzim-szubsztrát reakciói jeleznek. Az e források által termelt fényből következtetni lehet a fehérjék jelenlétére és koncentrációjára a mintában.

A technikák összehasonlítása

Míg a két módszer az antitest-antigén kölcsönhatás elvén alapul, a két technika között van néhány jelentős különbség. Az alábbiakban ezt bontjuk le lépésről lépésre.

Először is, mindkét technika esetében a mintát megfelelően elő kell készíteni. Az előkészítés meglehetősen jelentősen különbözik a kettő között. Az immunhisztokémia esetében a szövetmintákat méretüktől függően felszeleteljük vagy egészben hagyjuk.

A minták méretének határa általában 3 µm és 5 µm között mozog. Ezután a mintákat beágyazzák egy közegbe, általában paraffinviaszba vagy kriomédiába. Ezt követően a szeleteket tárgylemezekre helyezik, és növekvő erősségű alkoholos mosásokkal dehidratálják, végül a végén detergens hozzáadásával tisztítják a mintát, így az mikroszkóp alatt megtekinthetővé válik.

A Western blot esetében viszont a mintákat először elektroforézissel kell elválasztani, majd egy blotting membránban kell immobilizálni.

A minták festésének módszere is kissé eltér a két technika között. Az immunhisztokémia poliklonális vagy monoklonális antitesteket ad hozzá. Ezeket az antitesteket vagy elsődleges vagy másodlagos reagensek közé sorolják, az előbbiek a célantigén ellen termeltek, és általában nem konjugáltak, az utóbbiak egy linkermolekulához konjugáltak, amely aztán riportmolekulákat toboroz.

A konjugált változatot közvetlen festési módszerben használják, ahol az antitest közvetlenül reagál a mintában lévő antigénnel, a konjugálatlan változatot közvetett festési módszerben használják, ahol a jelöletlen antitest a szövetben lévő célantigénhez kötődik, és egy másodlagos antitest reagál az elsődleges antitesttel.

Ezzel szemben a Western blot módszer során a mintához fluoreszcens festéket adnak, majd megfelelő hullámhosszúságú fényforrásnak teszik ki, hogy a fluorofór molekulák gerjesztődjenek.

Egy idő után a gerjesztett fluorofórok végül leadják a fényforrásból nyert energiát, és visszatérnek alapállapotukba. Ez az energiafelszabadulás az, ami miatt a fluoroforok fluoreszkálnak, és olyan fényforrást bocsátanak ki, amelyet egy digitális képalkotó eszközzel rögzíteni lehet.

Az előnyök és hátrányok összehasonlítása

Az immunhisztokémia fő előnye, hogy a módszer lehetővé teszi a kutatók számára, hogy a szövetmintán belül pontosan kimutassák a célfehérje helyét. Ez a fő előnye vezetett ahhoz, hogy az idegtudományok területén az agyi célhelyeken történő fehérjeexpresszió vizsgálatának robusztus módszereként szilárdan meghonosodott.

A másik oldalon a módszer a Western blot módszerrel összehasonlítva jelentős hátrányt jelent. Ez az a tény, hogy a festődéseket nem ellenőrzik egy molekulatömeglétra alapján, mint a Western blot esetében, ami azt jelenti, hogy nem lehet bizonyítani, hogy az immunhisztokémiában kimutatott festődés egyértelműen egy adott fehérjéhez kapcsolódik.

Az immunhisztokémia indirekt módszere elismerten rendkívül érzékeny, a direkt módszer azonban éppen ellenkezőjéről ismert, és általában képtelen a célantigének kis koncentrációinak kimutatására.

A Western blot módszer előnye, hogy a mennyiségi adatok gyűjtésének megbízható technikájává vált. A legkiemelkedőbb előnye azonban az, hogy bizonyítottan hatékonyan képes olyan jelet generálni, amely arányos a mintában lévő fehérje mennyiségével.

A Western blot-ot gyakran választják azért is, mert számos célfehérje egyidejű kimutatására képes, aminek hatására jelentősen csökken a vizsgálati idő, valamint a szükséges erőforrások száma.

Az alkalmazások közötti különbség

A két technika alkalmazásai között nagy az átfedés, tekintve, hogy annyira hasonlóak. Összességében azonban az immunhisztokémiára leginkább számos rákos megbetegedés diagnosztikai eszközeként támaszkodnak.

A módszert bizonyos daganatokra jellemző kóros sejtek azonosítására használják. A módszert széles körben használják a normális és beteg szövetekben egyaránt megtalálható fehérjék és biomarkerek azonosítására és lokalizálására is. Végül a szövetekben található számos fertőző organizmus kimutatására is gyakran alkalmazzák.

A Western blotot ehhez képest leginkább autoimmun betegségek, allergiák és fertőző betegségek kimutatására használják. Széles körben alkalmazzák a molekuláris biológia, a biokémia és a sejtbiológia területén, legjelentősebb alkalmazásai a HIV és a BSE diagnosztikai eszközeként.

További olvasmányok

• Minden immunhisztokémiai tartalom
• Immunhisztokémiai (IHC) képalkotó technikák
• Enzimatikus immunhisztokémia (IHC)
• Multi-color immunhisztokémia (IHC)
• Hogyan működik az immunkémia?

Az író

Sarah Moore

A pszichológia, majd az idegtudományok tanulása után Sarah hamar megtalálta az örömét a kutatásban és a kutatómunkák írásában; szenvedélyévé vált, hogy az íráson keresztül összekösse az eszméket az emberekkel.

Hivatkozások