ARTIGOO ORIGINAL / ORIGINAL ARTICLE

DIAGNOSIS OF ALPHA-1-ANTITRYPSIN DEFICIENCY BY DNA ANALYSIS OF CHILDREN WITH LIVER DISEASE*

Adriana Maria Alves De TOMMASO1, Cláudio Lúcio ROSSI2, Cecília Amélia Fazzio ESCANHOELA3, Heliane Guerra SERRA4, Carmen Sílvia BERTUZZO5 és Gabriel HESSEL6

ABSZTRAKT ¾ Háttér – Az alfa-1-antitripszin hiány egy genetikai rendellenesség, amely autoszomális, együttesen domináns formában öröklődik. Az alfa-1-antitripszinhiány elsősorban a tüdőt és a májat érinti, ez utóbbi esetben újszülöttkori cholestasishoz, krónikus hepatitishez vagy májzsugorhoz vezet. Az alfa-1-antitripszinhiány pontos diagnózisát biokémiai vagy molekuláris elemzéssel lehet felállítani. Célkitűzés – E vizsgálat célja az volt, hogy DNS-analízis segítségével megvizsgáljuk az alfa-1-antitripszinhiány jelenlétét 12 olyan gyermeknél, akiknél felmerült a hiány gyanúja, és akiknél a betegség laboratóriumi és klinikai jellemzői mutatkoztak. Betegek és módszerek – Tizenkét, 3 hónapos és 19 éves kor közötti beteget vizsgáltunk, akiknek a szérum alfa-1-antitripszin szintje alacsonyabb volt a normálisnál és/vagy meghatározatlan etiológiájú májbetegségben szenvedtek. Az alfa-1-antitripszin gén S és Z mutáns alléljait vizsgálták a 12 gyermeknél. Az alfa-1-antitripszin génszerveződését a genom polimeráz láncreakcióval történő amplifikálásával és Xmnl (S allél) és Taq 1 (Z allél) restrikciós enzimekkel történő emésztéssel vizsgálták. Eredmények – A 12 beteg közül hétnek meghatározatlan etiológiájú krónikus májbetegsége volt, a másik öt betegnél pedig alacsony volt az alfa-1-antitripszin szérumszintje, valamint újszülöttkori cholestasis és/vagy meghatározatlan etiológiájú krónikus májbetegség diagnózisa. A 12 beteg közül ötnél homozigóta volt a Z allél (ZZ), kettőnél pedig az S allél és a Z-től eltérő másik allél (*S). Következtetés – Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az alfa-1-antitripszin hiánya viszonylag gyakori a meghatározatlan etiológiájú krónikus májbetegségben és/vagy alacsony alfa-1-antitripszin-szintben szenvedő gyermekeknél (41,6%). A helyes diagnózis fontos a hatékony klinikai követés és a genetikai tanácsadás szempontjából.

FÜGGÉSEK ¾ Alfa-1-antitripszinhiány. Molekuláris diagnózis. Májbiopszia.

BEVEZETÉS

Az alfa-1-antitripszin (A1AT) egy 52 kDa glikoprotein, amelyet főként a hepatociták termelnek, amelyek naponta 2 g ilyen fehérjét bocsátanak ki a véráramba(36). Az A1AT fő funkciója, hogy gátolja a neutrofil elasztáz, egy szerin proteáz hatását, amely hidrolizálja az elasztinrostokat a tüdőben(38). Az A1AT-ot kódoló gén mutációi olyan fehérjét eredményeznek, amely nem rendelkezik gátló képességgel, és az A1AT felhalmozódásához vezethet a hepatociták befogadó testecskéiben, ezáltal csökkentve e fehérje normális szérumszintjét(4). Ez a hiány tüdőtágulás, krónikus bronchitis vagy bronchiectasis formájában jelentkezik(9). A mutáns A1AT felhalmozódása a hepatocitákban újszülöttkori cholestasishoz, krónikus hepatopathiához vagy cirrózishoz is vezethet(33, 34).

Az A1AT gén erősen polimorf, ko-domináns és a 14. kromoszóma hosszabb karján (14q 31-32.3) található(20, 29). Hetven-¾5 allélt (az izoelektromos pontok szerint A-Z-vel jelölve) írtak le erre a génre a szérum poliakrilamid gélekben pH 4 (anód) és pH 5 (katód) közötti izoelektromos fókuszálása alapján. A közös változatok a gél közepére vándorolnak, és ezért az M (“középső”) családba tartoznak. Egy hiányos változat, amelyet eredetileg LAURELL és ERIKSSON írt le 1963-ban(21), a katód felé vándorol, és Z-nek nevezik. Egy másik változat, amely lassan mozog a gélben, S(5). Ezt a polimorf “locust” általában Pi (proteáz inhibitor) rendszerként ismerik. A legtöbb változat normál mennyiségű és minőségű A1AT-ot termel(7, 8, 25). Néhány allél, mint például az S és Z variánsok azonban hiányos állapottal társulnak, amely polimorf gyakoriságot ér el, mint a kaukázusi populációkban, és olyan null allél esetekről számoltak be, amelyben a fehérje termelődése teljesen hiányzik(10).

Az S allél a gén III. exonjában az adenin tiaminnal történő helyettesítéséből ered, ami a 264-es pozícióban lévő glutaminsav valinra cserélődéséhez és ennek következtében instabil fehérjeszerkezet kialakulásához vezet(10, 11, 19). A Z allél a gén V. exonjában a gén 342. pozíciójában lévő guanin adeninnel való helyettesítéséből ered, és olyan fehérje kialakulásához vezet, amely a hepatocita endoplazmatikus retikulum belső érdes felületén gyűlik össze(6). A hiányállapot diagnózisát általában a fehérje szérumszintjének kvantitatív meghatározása és az izoelektromos fókuszálást követő elektroforetikus profil meghatározása után állítják fel(23, 37). A pontosabb diagnózishoz DNS-alapú technikákkal végzett génelemzésre van szükség(12, 14, 26).

A vizsgálat célja az S és Z allél hordozóinak azonosítása volt azoknál a betegeknél, akiknél felmerült a hiány gyanúja, és akiknél a betegség laboratóriumi és klinikai jellemzői mutatkoztak.

PATIENSEK ÉS MÓDSZEREK

Páciensek

Az 1988 februárja és 1997 augusztusa közötti időszakban nagyszámú beteget utaltak be a Campinas-i Állami Egyetem (Campinas, SP, Brazília) Gyermekgasztroenterológiai Szolgálatára májbetegségek kivizsgálása céljából. Ebből a betegszámból csak 12 betegnél nem állítottak fel egyértelmű diagnózist (vírushepatitisre, autoimmun hepatitisre és Wilson-kórra negatív eredményt kaptak). Ezeknél a betegeknél elvégezték az A1AT molekuláris analízisét.

Módszerek

1 ¾ vizsgálati protokoll

2 – Májbiopszia

A perkután májbiopsziát a MOWAT(24) által leírtak szerint vettük helyi érzéstelenítésben, legalább 4 órán át koplaltatott, vénásan éhező és normális prothrombinaktivitású betegeknél. A nyert darabot azonnal 10%-os formalinba helyeztük, majd feldolgoztuk, és hematoxilin-eozinnal, Masson-trikrómával, poroszkékkel és a retikulumrostok ezüst impregnálásával festettük. Speciális festést kaptunk PAS (periodikus savas-Schiff) festéssel, amelyet diasztázzal való kezelés követett. Az eozinofilnek tűnő citoplazmatikus szemcsék fennmaradását még a diasztáz alkalmazása után is pozitívnak tekintettük az A1AT-hiányra.

3 – Molekuláris analízis

Az A1AT S és Z mutáns alléljainak vizsgálatára a perifériás vér leukocitáiból DNS extrakciót végeztünk a WOODHEAD és munkatársai által leírt módszer szerint (39).

Eredmények

A 12 vizsgált gyermek közül öt volt Z homozigóta (ZZ), míg két gyermeknél az S allél egy másik, nem Z alléllal együtt volt jelen (*S). Az 1. táblázat mutatja a betegek életkorát a vérvétel időpontjában és a későbbi elemzésre vonatkozó döntés indikációját. Három betegnél az újszülöttkori cholestasis a krónikus hepatopathia kezdeti manifesztációjaként jelentkezett.

A 2. táblázat az ALT, AP, gGT, A1AT szérumszintjét, valamint a molekuláris vizsgálat és a májbiopszia eredményeit mutatja.

A ZZ genotípussal rendelkező öt beteg szérum A1AT-szintje csökkent, és a májbiopszia cirrózist (egy), újszülöttkori hepatitist (kettő), az interlobuláris epevezetékek hiányát (egy) és krónikus hepatitist (egy) mutatott ki. Ez utóbbi esetben (FSP) a periportalis hepatocitákban HE-vel történő festést követően eozinofilnek tűnő citoplazmatikus granulumok voltak láthatók, amelyeket utólagosan PAS-pozitivitás és diasztázrezisztencia igazolt (1. ábra). A két újszülöttkori cholestasisban szenvedő betegnél (EKBA és RHBP) 10, illetve 13 hetes korukban májbiopsziát végeztek, és eozinofil PAS-pozitív, diasztázrezisztens göböket mutattak ki.

A 2. és 3. ábrán az S és Z allélok amplifikációjának és emésztésének eredményei láthatók.

Összefoglalás

Az alfa-1-antitripszinhiány az egyik leggyakoribb genetikai rendellenesség, amely gyermekeknél májbetegséghez vezet, és ez a leggyakoribb májtranszplantációt igénylő genetikai betegség(17, 28). Az A1AT-hiány Észak-Amerikában és Észak-Európában 1600-2000 újszülöttből 1-et érint(28, 31), de az ilyen hiányban szenvedő populációnak csak 10-15%-ánál alakul ki májbetegség(32, 33). A SVEGER 1988-ban publikált tanulmánya szerint(33) az újszülöttkori időszakban a PIZZ fenotípusú betegek 11%-ánál alakul ki ictericus hepatitis. Ebben a tanulmányban három A1AT-hiánnyal diagnosztizált betegnél fordult elő újszülöttkori kolestasis, és közülük kettőnél, mielőtt a hiány biztos diagnózisát felállították volna, a kolestasist idiopátiásnak tekintették. Az irodalomban közölt idiopátiás újszülöttkori hepatitis esetek 5-10 százalékát A1AT-hiány okozza(3).

Öt vizsgált, ilyen hiányban szenvedő betegnél az A1AT szérumszintje a normál alsó határérték alatt volt. Ez a vizsgálat azonban nem erősítette meg feltétlenül a betegség diagnózisát. Mivel az A1AT az akut gyulladásos fázis fehérjéje, szintézise megnő gyulladásos/fertőző állapotokban, daganatos betegségekben, terhességben, valamint ösztrogén- és kortikoszteroid-kezelés során(16, 22). Az A1AT szérumszintjének csökkenése újszülöttek légzési szorongásos szindrómájában, a májelégtelenség terminális fázisában, cisztás fibrózisban és olyan helyzetekben fordul elő, amikor nagy a fehérjeveszteség(15). Az SZ genotípusokban, amelyek elméletileg májbetegségeket eredményezhetnek, a szérumszintek általában normálisak.

Újszülöttkori cholestasis esetén alapvetően szükséges az extrahepatikus biliaris atresiával való differenciáldiagnózis. A klinikai anamnézis az esetek 83%-ában lehetővé teszi az adekvát diagnózist(1) , és a diagnózis pontosságának javítása érdekében specifikus vizsgálatokra van szükség. E vizsgálatok közül a májbiopszia kiemelt jelentőségű. Az A1AT-hiányos betegek májbiopsziájában észlelt szövettani elváltozások megegyezhetnek az idiopátiás újszülöttkori hepatitisben vagy extrahepatikus epeúti atresia esetén megfigyeltekkel(24). A túlnyomórészt periportális, intrahepatocisztás globulák jelenléte, amelyek diasztáz emésztés után erősen PAS-pozitívak, az A1AT-hiány hasznos jele(13, 18, 27). Ezeket a globulusokat azonban nehéz azonosítani a születést követő 12. hét előtt(35). Ebben a vizsgálatban az EKBA beteg májszövetében 10 hetes korban a fenti jellemzőkkel rendelkező globulák voltak. A JCI betegnél (13 hetes korban) nem láttak ilyen gömböcskéket. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a globulusok jelenlétét speciális festéssel kell vizsgálni a 12 hetes kor előtt nyert májtöredékekben, bár a negatív eredmény nem zárja ki az A1AT-hiány lehetőségét. Biokémiai analízist ebben a vizsgálatban nem alkalmaztunk, mivel a pontosabb DNS-analízisre volt lehetőség.

Az A1AT-hiány viszonylag gyakori a meghatározatlan etiológiájú májbetegségben szenvedő gyermekeknél. Ez a diagnózis alulbecsült, valószínűleg azért, mert pontatlan diagnosztikai módszereket alkalmaznak. A molekuláris analízis pontosabb diagnózist biztosít, és hasznos lehet az ismeretlen etiológiájú májbetegségben szenvedő betegek genetikai tanácsadásában is.

De Tommaso AMA, Rossi CL, Escanhoela CAF, Serra HG, Bertuzzo CS, Hessel G. Diagnóstico da deficiência de alfa-1-antitripsina por estudo molecular em crianças com doença hepática. Arq Gastroenterol 2001;38(1):63-68.

RESUMO – Racional – A deficiência de alfa-1-antitripsina é uma doença genética transmitida de forma autossômica co-dominante. As manifestaçőes clínicas principais incluem acometimento pulmonar e hepático. Este último, apresenta-se como colestase neonatal, hepatite crônica ou cirrose. A végleges diagnózis az alfa-1-antitripszin biokémiai elemzésével vagy molekuláris elemzéssel állítható fel. Objetivo – Vizsgáljuk 12 gyermekcsoportban, akiknél fennáll az alfa-1-antitripszina hiányának gyanúja, a DNS-analízis alapján a hiány jelenlétét, hogy diagnosztizálni lehessen, valamint az alfa-1-antitripszina hiányának és az észlelt klinikai és laboratóriumi jellemzőknek az összefüggését. Esettan és módszerek – Az alfa-1-antitripszin gén S és Z mutáns alléljait vizsgálták 12 betegnél, akiknek életkora 3 hónap és 19 év között volt, az Universidade Estadual de Campinas (SP, Brazília) gyermek gasztroenterológiai ambulanciája által a normálisnál alacsonyabb szérum alfa-1-antitripszin szint és/vagy meghatározott etiológia nélküli májbetegség miatt. A DNS-elemzést módosított polimeráz láncreakciós génamplifikációs módszerrel végeztük, amely az Xmnl (S allél) és a Taq l (Z allél) enzimek számára restrikciós helyeket hoz létre. Eredmények – A 12 beutalt beteg közül 7-nek krónikus májbetegsége volt meghatározott etiológia nélkül, a másik 5 betegnek pedig alacsony szérum alfa-1-antitripszin dózisa volt, amelyet újszülöttkori kolestázis és/vagy ismeretlen etiológiájú krónikus májbetegség diagnózisa kísért. Ebben a 12 betegből álló csoportban öt homozigóta Z (ZZ) beteget figyeltek meg, kettő pedig az S allélt hordozta egy másik, a Z-től eltérő alléllal együtt (*S). Következtetés – Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az A1AT-hiány viszonylag gyakori etiológia a krónikus májbetegségben szenvedő, meghatározott etiológia és/vagy alacsony szérum A1AT-dózisú (41,6%) gyermekeknél. A hiány biztos diagnózisának fontossága nemcsak a beteg klinikai követése szempontjából indokolt, hanem a genetikai tanácsadás szempontjából is.

DESZKRITOROK ¾ Alfa-1-antitripszin hiány. Molekuláris diagnózis. Májbiopszia.

1. Alagille D. Cholestasis az élet első három hónapjában. Prog Liver Dis 1979;6:471-85.

2. Andresen BS, Knudsen I, Jensen PKA, Gregersen N. Két új, nem radioaktív polimeráz láncreakción alapuló, szárított vérfoltokból, genomiális DNS-ből vagy teljes sejtekből végzett vizsgálat az alfa-1-antitripszin gén Z és S mutációinak gyors és megbízható kimutatására. Clin Chem 1992;38:2100-7.

5. Brantly M, Nukiwa T, Crystal RG. Az alfa-1-antitripszin hiány molekuláris alapjai. Am J Med 1988;84:13-31.

6. Carlson JA, Rogers RB, Sifers R. A PiZ alfa-1-antitripszin felhalmozódása májkárosodást okoz transzgenikus egerekben. J Clin Invest 1989;83:1183-90.

8. Cox DW, Woo SL, Mansfield T. Az alfa 1-antitripszinhez kapcsolódó DNS restrikciós fragmentumok a PI Z hiányallél egyetlen eredetére utalnak. Nature 1985;316:79-81.

9. Crystal RG, Brantly ML, Hubbard RC, Curiel DT, States DJ, Holmes MD. Az alfa 1-antitripszin gén és mutációi. Klinikai következmények és terápiás stratégiák. Chest 1989;95:196-208.

11. Curiel D, Brantly M, Curiel E, Crystal RG. Az alfa-1-antitripszin Nullmattawa gén által okozott alfa-1-antitripszin hiány. Az alfa-1-antitripszin gén inszerciós mutációja, amely képtelenné teszi az alfa-1-antitripszin termelésére. J Clin Invest 1989;83:1144-52.

12. Dermer SJ, Johnson EM. Az alfa-1-antitripszin hiány gyors DNS-analízise: egy továbbfejlesztett módszer alkalmazása a mutált génszekvencia amplifikálására. Lab Invest 1988;59:403-8.

13. Deutsch J, Becker H, Auböck L. A májbetegség szövettani jellemzői alfa 1-antitripszinhiányban. Acta Paediatr 1994;393 Suppl:8-12.

14. Dubel JR, Finwick R, Hejtmancik JF. Az alfa 1-antitripszin gén denaturáló gradiens gélelektroforézise: alkalmazás a prenatális diagnosztikában. Am J Med Genet 1991;41:39-43.

15. Evans HE, Levi M, Mandl I. Szérum enzim inhibitor koncentrációk a légzési distressz szindrómában. Am Rev Resp Dis 1970;101:359-63.

18. Ishak KG. Hepatikus morfológia örökletes metabolikus betegségekben. Sem Liver Dis 1986;6:246-58.

20. Lai EC, Kao FT, Law ML, Woo SL. Az alfa 1-antitripszin gén és egy szekvenciával kapcsolatos gén hozzárendelése a 14-es humán kromoszómához molekuláris hibridizációval. Am J Hum Genet 1983;35:385-92.

21. Laurell CB, Eriksson S. A szérum elektroforetikus alfa-1-globulin mintázata alfa-1-antitripszin hiányban. Scand J Clin Lab Invest 1963;15:132-40.

22. Laurell CB, Kullander S, Thorell J. Kombinált strogén-progesztin fogamzásgátló adásának hatása az egyes plazmafehérjék szintjére. Scand J Clin Lab Invest 1968;21:337-43.

23. Massi G, Chiarelli C. Alfa 1-antitripszin: molekuláris és a Pi rendszer. Acta Paediatr 1994;393 Suppl:1-4.

26. Okayama H, Curiel DT, Brantly ML, Holmes MD, Crystal RG. Mutációk gyors, nem radioaktív kimutatása a humán genomban allélspecifikus amplifikációval. J Lab Clin Med 1989;114:105-13.

28. Perlmutter DH. Az alfa 1-antitripszin hiány klinikai manifesztációi. Gastroenterol Clin North Am 1995;24:27-43.

30. Serra HG. Identificação molecular dos alelos S e Z do gene da alfa-1-antitripszin em um grupo de pacientes portadores de doença pulmonar crônica . Campinas, SP: Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas; 1998.

31. Silverman EK, Miletich JP, Pierce JA, Sherman LA, Endicott SK, Broze GJ, Campbell EJ. Alfa-1-antitripszin hiány. Közvetlen lakossági szűréssel megállapított magas prevalencia St. Louis térségében. Am Rev Respir Dis 1989;140:961-6.

32. Sveger T. 200 000 csecsemő szűrésével kimutatott májbetegség alfa-1-antitripszinhiányban. N Engl J Med 1976;294:1316-21.

33. Sveger T. A májbetegség természetes lefolyása alfa 1-antitripszinhiányos gyermekeknél. Acta Paediatr Scand 1988;77:847-51.

35. Talbot IC, Mowat AP. Májbetegség csecsemőkorban. Histológiai jellemzők és kapcsolat az alfa 1-antitripszin fenotípussal. J Clin Pathol 1975;28:559-63.

36. Travis J, Salvesen GS. Humán plazma proteináz inhibitorok. Annu Rev Biochem 1983;52:655-709.

37. Van Steenbergen W. Alfa 1-antitripszin hiány: áttekintés. Acta Clin Belg 1993;48(3):171-89.

38. Wewers MD, Casolaro MA, Sellers SE, Swayze SC, McPhaul KM, Wittes JT, Crystal RG. A tüdőtágulással összefüggő pótlóterápia-hiány. N Engl J Med 1987;316:1055-62.

Recebido em 3/11/1999.
Aprovado em 6/11/2000.

* A tanulmányt a Campinas-i Állami Egyetem (UNICAMP, Campinas, SP, Brazília) Orvosi Tudományok Karának (FCM) Gyermekgyógyászati, Orvosi Genetikai, Anatómiai Patológiai és Klinikai Patológiai Tanszékei végezték.

1 Posztgraduális hallgató. Gyermekgyógyászati Tanszék, FCM/UNICAMP.

2 Professzorhelyettes. Klinikai Patológiai Tanszék, FCM/UNICAMP.

3 Professzorhelyettes. Anatómiai Patológiai Tanszék, FCM/UNICAMP.

4 Genetikai PhD (Biológiai Intézet), UNICAMP.

5 Professzorhelyettes. Orvosi Genetikai Tanszék, FCM/UNICAMP.

6 Professzorhelyettes. Gyermekgyógyászati Tanszék, FCM/UNICAMP.