- Abstract
- 1. Bevezetés
- 2. Anyagok és módszerek
- 2.1. Szervezetek és tenyésztési körülmények
- 2.2. Mágneses keverőgépen a kapott biomasszát szűrtük, háromszor dH2O-val mostuk, és 50°C-on tömegállandóságig szárítottuk. A gombakivonatok előállítása
- 2.3. Genoprotektív aktivitás
- 2.3.1. Alanyok
- 2.3.2. A vizsgálatban részt vettek. Vizsgálati terv
- 2.3.3. Az egysejtes gélelektroforézis-teszt
- 2.4. Antioxidáns aktivitás
- 2.4.1. DPPH- Assay
- 2.4.2. Az összes fenoltartalom meghatározása
- 2.4.3. Az összes flavonoidtartalom meghatározása
- 2.5. Statisztikai elemzés
- 3. Eredmények és megbeszélés
- 3.1. Eredmények és megbeszélés 3.1. Eredmények és megbeszélés. Kivonási hozam
- 3.2. A legjobb oldószerek az alkoholok. Genoprotektív aktivitás
- 3.3. Az antioxidáns-kapacitás növelése a sejtekben. Antioxidáns aktivitás
- 4. Következtetés
- Érdekellentét
- Köszönet
Abstract
A Trametes fajokat évezredek óta használják a hagyományos és hagyományos orvoslásban különböző betegségek kezelésére. A célunk az volt, hogy felmérjük a kiválasztott Trametes fajok micélium- és bazídiumkocsány-kivonatainak lehetséges antigenotoxikus hatásait, valamint az antioxidáns potenciáltól való függésüket. A vizsgált fajok a Trametes versicolor, a T. hirsuta és a T. gibbosa voltak. A kivonatok antigenotoxikus potenciálját emberi perifériás fehérvérsejteken vizsgáltuk a fajok bazídiumkocsány- és micéliumkivonataival. A lúgos comet-tesztet használták a DNS-szálszakadások és a lúggal labilis helyek kimutatására, valamint a DNS-migráció mértékének meghatározására. A DPPH-tesztet a kivonatok antioxidatív tulajdonságainak becslésére használták. A T. versicolor és a T. gibbosa, valamint a T. hirsuta termőtest-kivonatai, kivéve a 20,0 mg/ml-t, nem voltak genotoxikus hatásúak. A T. versicolor kivonatnak 5,0 mg/ml-nél volt a legnagyobb antigenotoxikus hatása mind a leukociták elő-, mind utókezelése során. A három faj micélium-kivonatának nem volt genotoxikus aktivitása és jelentős antigenotoxikus hatása a H2O2 által kiváltott DNS-károsodással szemben, mind elő-, mind utókezelésben. Az eredmények arra utalnak, hogy e három faj kivonatai erős antigenotoxikus szereknek tekinthetők, amelyek képesek stimulálni a sejtek genoprotektív válaszát.
1. Bevezetés
A gombákat régóta használják élelmiszerként, de ugyanúgy a hagyományos gyógyászatban a nyugati és a keleti világban is . Annak ellenére, hogy számos gombát egészséges élelmiszerként ismernek el , nagy farmakológiai potenciáljukat még mindig nem használják ki kellőképpen. Közel 60 Trametes faj ismert a világon , de csak néhányukat vizsgálják gyógyászati tulajdonságaik szempontjából . A Trametes versicolor (L.:Fr.) Lloyd a nemzetség leghíresebb gyógyhatású faja. Ezt a fajt, amelynek népi neve a nyugati kultúrákban Turkey Tail, Kínában Yun-Zhi (felhőszerű gomba) vagy Japánban Kawaratake (folyóparti gomba), évezredek óta használják a hagyományos gyógyászatban, különösen Ázsiában . A Ming-dinasztia idején írt Compendium of Chinese Materia Medica szerint a T. versicolor több mint 120 fajtáját jegyezték fel, és a hagyományos kínai gyógyászati gyakorlatban ezt a gombát hasznosnak tartják a méreganyagok eltávolítására, erősítésére, az energia növelésére, a máj és a lép működésének javítására, valamint az immunválasz fokozására, különösen, ha szárítják, őrlik és teává készítik . Mindezeket a tulajdonságokat nagyon hasznosnak tartották a népi gyógyászatban a Trametes spp. készítmények krónikus használatára . A hagyományos orvoslásban a fajt főként különböző típusú rákos megbetegedések kezelésére használják, de krónikus májgyulladás, reumás ízületi gyulladás, valamint a légúti, húgyúti és emésztőrendszeri fertőzések kezelésére is, amit számos tanulmány is megerősített . Emellett a T. versicolorból izolált egyes poliszacharopeptidek erős vírusellenes hatásáról és a Trametes spp. termőtest-kivonatok jelentős antioxidáns hatásáról számoltak be . Ezek a hatások főként a poliszacharid krestin (PSK) és különböző poliszacharid-peptid komplexek termelésén alapulnak, olyan vegyületek, amelyek csökkentik a rákos áttéteket és serkentik az interleukin-1 termelését az emberi sejtekben .
A szabad gyökök bőséges jelenléte a környezetben összefügg az oxidatív stressz megjelenésével, amely az öregedés és a különböző betegségek és rendellenességek, amelyekben a világ népességének nagy része szenved és meghal, kialakulásának és előrehaladásának alapja . A DNS érzékenyebb az oxidatív károsodásra, mint más makromolekulák. A DNS-károsodást, mint például a szálszakadások, különböző anyagok idézhetik elő, amelyek közül a H2O2 genotoxikus hatást fejt ki. Ismeretes, hogy ezek a károsodások nemcsak a gyulladásos betegségekben, hanem a rákos megbetegedésekben is befolyásolhatják az immunválaszt . A comet-teszt egy jól ismert és hatékony, nagy érzékenységű teszt, amelyet a DNS-károsodás vizsgálatára használtak, és számos természetes termék genotoxikus és védő potenciáljának értékelésére alkalmazható .
A gombakivonatoknak a DNS oxidatív károsodásainak csökkentésén alapuló genoprotektív hatása szintén jelentős szerepet játszhat számos említett betegség és rendellenesség megelőzésében és kezelésében, de napjainkig nagyon kevés tanulmány tekintette ezt a különböző terápiák lehetséges hatásmechanizmusának . Ezért a vizsgálat célja a kiválasztott Trametes fajok micélium- és bazídium-kivonatainak emberi perifériás fehérvérsejtekre gyakorolt antigenotoxikus hatásainak értékelése, valamint az antioxidáns potenciáltól való függésük felmérése volt.
2. Anyagok és módszerek
2.1. Szervezetek és tenyésztési körülmények
A Trametes versicolor BEOFB 321, T. hirsuta BEOFB 301 és T. gibbosa BEOFB 310 kultúráit Szerbiából gyűjtött termőtestekből izoláltuk, és a Belgrádi Egyetem Biológiai Karának Botanikai Intézetének (BEOFB) tenyésztési gyűjteményében maláta agar táptalajon tartottuk.
A beoltást 100,0 ml szintetikus táptalaj beoltásával végeztük (glükóz, 10.0 g L-1; NH4NO3, 2,0 g L-1; K2HPO4, 1,0 g L-1; , 0,4 g L-1; , 0,5 g L-1; élesztőkivonat, 2,0 g L-1; pH 6,5) 25 micéliumkoronggal (Ø 0.5 cm, 7 napos kultúrából, maláta agarról) 250 ml-es lombikokban, majd 100 fordulat/perc fordulatszámon, szobahőmérsékleten (°C) 7 d-ig rotációs rázógépen inkubáltuk. Az így kapott biomasszát megmostuk és laboratóriumi turmixgépben 100,0 ml steril desztillált vízzel (dH2O) homogenizáltuk. A homogenizált biomasszát (30,0 ml) 500,0 ml módosított szintetikus táptalaj beoltásához használtuk (65,0 g L-1 glükózzal). A merített tenyésztést 1000 mL-es lombikokban végeztük szobahőmérsékleten, forgó rázógépen 21 napig. A kapott biomasszát megszűrtük, mágneses keverőn háromszor dH2O-val mostuk, és 50°C-on tömegállandóságig szárítottuk.
2.2. Mágneses keverőgépen a kapott biomasszát szűrtük, háromszor dH2O-val mostuk, és 50°C-on tömegállandóságig szárítottuk. A gombakivonatok előállítása
A szárított termőtestet és micéliumot (3,0 g) 90,0 ml 96%-os etanollal keverve extraháltuk 30°C-on 72 órán keresztül. Az így kapott kivonatokat centrifugáltuk (20°C, 3000 rpm, 15 perc), a felülúszókat Whatman 4-es számú szűrőpapíron átszűrtük, 40°C-on rotációs elpárologtatóban (BÜCHI R-114, Svájc) csökkentett nyomáson szárazra koncentráltuk, majd antioxidáns vizsgálathoz 96%-os etanolban, illetve antigenotoxikus vizsgálathoz vízben újra feloldottuk 20,0 mg mL-1 kezdeti koncentrációra. Az extrakciós hozamot száraz tömegre vonatkoztatott százalékban fejeztük ki.
2.3. Genoprotektív aktivitás
2.3.1. Alanyok
Heparinizált teljes vérmintákat nyertünk vénapunkcióval három egészséges, 25 év alatti donortól. A vizsgálatban résztvevők nemdohányzók és nem alkoholisták voltak, nem részesültek semmilyen terápiában vagy gyógyszeres kezelésben, és nem szedtek étrend-kiegészítőket.
2.3.2. A vizsgálatban részt vettek. Vizsgálati terv
Az összes kivonat és koncentráció (20,0, 10,0, 5,0, 2,5, 1,25, 0,625 és 0,312 mg ml-1) genotoxicitását emberi perifériás fehérvérsejtek 37°C-on történő 30 perces kezelésével vizsgálták a DNS-károsodás értékelése céljából. Általában fehérvérsejteket használnak, mert viszonylag nem invazív módon nyerhetők, nem igényelnek szöveti szétbontást, és jól viselkednek a comet-tesztben . Pozitív kontrollként 37°C-on 30 percig foszfát pufferelt sóoldattal (PBS) történő kezelést alkalmaztunk, negatív kontrollként pedig 25,0 μM H2O2-vel történő, jégen 15 percig tartó kezelést.
A kivonatok antigenotoxikus potenciáljának értékelésére két független protokollt alkalmaztunk, a kivonatokkal történő elő- és utókezeléssel. Az előkezelés során a sejteket 37°C-on 30 percig inkubáltuk a kivonatokkal, majd PBS-szel mostuk, és 15 percig H2O2-nek tettük ki. Az utókezelés során a sejteket 15 percig jégen H2O2-vel kezeltük, majd PBS-szel öblítettük, és ezt követően a hét kivonatkoncentrációval kezeltük 37°C-on 30 percig. Minden egyes kezelés után a sejteket PBS-szel mostuk. A 37°C-on 30 percig PBS-szel történő inkubáció volt a negatív kontroll, a 25,0 μM H2O2-vel történő 15 perces jégen történő kezelés pedig a pozitív kontroll.
Minden kísérlethez három ismétlést végeztünk, és mindegyikhez 100 sejtmagot elemeztünk.
2.3.3. Az egysejtes gélelektroforézis-teszt
A comet-tesztet a Singh et al. által leírtak szerint végeztük. A lúgos comet-teszt képes a DNS-szálszakadások és a lúgos-labilis helyek kimutatására, és a DNS-migráció mértéke jelzi a sejtek DNS-károsodásának mértékét.
A teljes vérmintákat (6,0 μL) 0,67%-os, alacsony olvadáspontú (LMP) agarózban (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), majd 1%-os normál olvadáspontú agaróz (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) réteggel előzetesen bevont, szuperfagyasztott üveg mikroszkópos tárgylemezekre pipettáztuk, fedőlemezzel szétterítettük, és 5 percig jégen tartottuk, hogy megszilárduljon. A fedőlemezek óvatos eltávolítása után a tárgylemezeken lévő sejtszuszpenziókat a fent leírtak szerint kezeltük a kivonatokkal és H2O2-vel. A kezeléseket követően minden tárgylemezt a harmadik réteg 0,5%-os LMP agarózzal fedtünk be, és ismét 5 percig jégen hagytuk megszilárdulni. A fedőlemezek eltávolítása után a tárgylemezeket hideg lizingoldatba (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X100 és 10% dimetil-szulfoxid, NaOH-val beállított pH 10,0) helyeztük 4°C-on egy éjszakára, majd elektroforézisnek és etídium-bromiddal történő festésnek vetettük alá. Az üstökösöket egy Olympus ×50 mikroszkóp (Olympus Optical Co., Gmbh Hamburg, Németország) segítségével figyeltük meg és elemeztük, amely 100x-os nagyítású fluoreszcenciát rögzítő eszközzel volt felszerelve. A DNS-károsodás értékelését az Anderson és munkatársai által leírtak szerint végeztük. A sejteket ugyanis szemmel öt kategóriába sorolták, amelyek a következő DNS-mennyiségeknek feleltek meg a farokban: (A) nincs károsodás, <5%; (B) alacsony szintű károsodás, 5-20%; (C) közepes szintű károsodás, 20-40%; (D) magas szintű károsodás, 40-95%; (E) teljes károsodás, >95% (1. ábra). Az elemzést alanyonként 100 véletlenszerűen kiválasztott sejten végeztük el (50 sejt 2 ismétlődő tárgylemezről). Az adatok szemikvantitatív elemzése érdekében a DNS-károsodást 5% feletti DNS-migrációként jellemeztük (B + C + D + E comet-osztályok).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
2.4. Antioxidáns aktivitás
2.4.1. DPPH- Assay
Az antioxidáns aktivitást a stabil 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil gyök lila színű metanolos oldatának fehérítésének mérésével határoztuk meg () . A fosztóhatást spektrofotometriásan (CECIL CE 2501) 517 nm-en mértük, és a következő egyenlet alapján számoltuk ki:ahol a negatív kontroll (kivonat nélküli reakcióelegy) abszorbanciája és a reakcióelegy abszorbanciája.
A csökkentés 50%-át biztosító kivonatkoncentrációt (mg kivonat/mL) (EC50) lineáris regressziós elemzés interpolációjával kaptuk. A statisztikai elemzéshez minden mérést három példányban végeztünk. Pozitív kontrollként a kereskedelmi forgalomban kapható antioxidánst, a butilált hidroxianizolt (BHA) használtuk, 20,0 mg mL-1-0,02 mg mL-1 koncentrációtartományban.
2.4.2. Az összes fenoltartalom meghatározása
A micéliumkivonatokban lévő összes fenolvegyületeket Folin-Ciocalteu reagenssel becsültük Singleton és Rossi módszere szerint, standardként a galluszsavat használva. A koncentrációt μg galluszsav-egyenértékben (GAE) határoztuk meg mg száraz kivonatra vonatkoztatva, egy standard galluszsav grafikonból nyert egyenletet használva,
2.4.3. Az összes flavonoidtartalom meghatározása
A teljes flavonoidtartalmat Park et al. módszere szerint határoztuk meg, standardként kvercetin felhasználásával. A mennyiséget μg kvercetin-egyenértékben (QE) fejeztük ki mg száraz kivonatra vetítve, a standard kvercetin-hidrát grafikonjából kapott egyenletet használva
2.5. Statisztikai elemzés
Az eredményeket három párhuzamos mérésből kapott adatok átlaga ± standard hiba értékeként fejeztük ki. A szignifikáns különbségek tesztelésére egyirányú varianciaanalízist (ANOVA) végeztünk a STATISTIKA szoftver 5.0 verziójával (StatSoft Inc.). 0,01-nél kisebb értékeket tekintettünk statisztikailag szignifikánsnak. A comet-tesztből származó adatok statisztikai elemzését a Statgraph 4.2 szoftver segítségével χ2-teszttel végeztük. A χ2-teszt elvégzéséhez a három kísérlet eredményeit összevontuk, és értékeltük a DNS-károsodott sejtek teljes számát. A különbséget statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.
3. Eredmények és megbeszélés
3.1. Eredmények és megbeszélés
3.1. Eredmények és megbeszélés. Kivonási hozam
A micélium biomassza kivonási hozama mindhárom faj esetében szignifikánsan magasabb volt a termőtesthez képest (). A T. gibbosa esetében volt a legmagasabb a szárított micélium biomassza extrakciós hozama (34,6%) és a legalacsonyabb a szárított termőtesteké (2,2%). A legmagasabb, 6,67%-os termőtest-kivonási hozamot a T. versicolor esetében találták, amelynek micélium-kivonási hozama 8,0% volt. A T. hirsuta esetében a hozam 12,0% (micélium esetében) és 2,85% (termőtest esetében) volt. A fajok közötti különbségek az extrakciós hatékonyságban mind a micélium, mind a termőtest esetében statisztikailag szignifikánsak voltak ().
A korábbi jelentések kimutatták a biomassza extrahálhatóságának függését a fajtól, a törzstől és az oldószertől. Így Ren és munkatársai megállapították, hogy a T. gibbosa basidiocarp extrakciós hozama 1,22% volt petróleuméteres kivonat esetén, 6,44% etil-acetát és 9,2% metanolos kivonat esetén. A metanol szintén jó oldószer volt a T. versicolor basidiocarp esetében, amelynek hozama 4,1% és 9,16% között mozgott. Eredményeink alapján megállapítható, hogy az alkoholok a legjobb oldószerek, de az etanol gyengébb, mint a metanol.
3.2. A legjobb oldószerek az alkoholok. Genoprotektív aktivitás
Mivel minden véradó jó egészségi állapotú és hasonló korú volt, és nem állt gyógyszeres kezelés alatt, a statisztikai elemzés nem mutatott egyértelmű különbségeket a kivonatokra adott reakcióikban. Ezért a három kísérlet eredményeit összevonták. A perifériás vér leukocitáinak H2O2-vel történő kezelése gyors és erőteljes egyszálú törések indukcióját okozta a nukleáris DNS-ben, ami a comet-tesztben DNS-migrációként volt látható.
Eredményeink azt mutatták, hogy a T. versicolor termőtest-kivonatok 0,312-20.0 mg mL-1 nem okozott szignifikáns növekedést a DNS-károsodott sejtek teljes számában a pozitív kontrollhoz képest, ami egyértelműen azt mutatja, hogy a vizsgált kivonat nem volt genotoxikus szer (2. ábra a) (A)). Az összes DNS-károsodás eloszlása (értéke) is megegyezett a pozitív kontrolléval. Másrészt ezek a kivonatok védőhatást mutattak a H2O2-vel szemben mind a leukociták elő-, mind utókezelése során (2(a) (B, C) ábra). Az 5,0 mg mL-1 koncentrációjú kivonatnak volt a legnagyobb, a 20,0 mg mL-1 koncentrációjúnak pedig a legkisebb hatása mindkét kezelésben. Az összes DNS-károsodás értéke statisztikailag minden koncentrációban csökkent a pozitív kontrollhoz képest ().
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
A T. hirsuta termőtest kivonata a 20,0 mg mL-1 kivételével minden koncentrációban nem mutatott genotoxikus aktivitást, mivel az összes DNS-károsodás szintje statisztikailag nem volt magasabb, mint a pozitív kontrollé (2. ábra b) (A)). Azonban 20,0 mg mL-1 koncentrációnál a genotoxikus hatás és az összes DNS-károsodás a sejtekben statisztikailag különbözött a pozitív kontrollhoz képest. A leukociták elő- és utókezelése során a kivonat a legmagasabb koncentráció kivételével minden koncentrációban védő hatást mutatott a H2O2 által kiváltott DNS-károsodással szemben, az összes DNS-károsodás szignifikáns csökkenését mutatta a pozitív kontrollhoz képest (2(b) (B, C) ábra). Ezek a kezelések dózisfüggő összefüggést mutattak, a legnagyobb védőhatást a 0,312 mg mL-1 kivonat koncentrációnál tapasztaltuk, míg a 20 mg mL-1 koncentráció nem mutatott védelmet a H2O2 által indukált üstökösökkel szemben.
A genotoxikus, valamint a szignifikáns antigenotoxikus hatás hiánya, azaz a H2O2 által indukált DNS-károsodás csökkentése mind az elő-, mind az utókezelés során a T. gibbosa termőtest kivonat esetében is megfigyelhető volt a hét koncentrációnál (2. ábra (c)). A T. hirsuta kivonatokkal ellentétben azonban a T. gibbosa basidiocarp kivonatoknál nem volt megfigyelhető dózisfüggő válasz; nevezetesen a kivonat koncentrációjának fokozatos csökkenése nem felelt meg a H2O2 által kiváltott genotoxicitás arányos csökkenésének.
A T. versicolor, a T. hirsuta és a T. gibbosa micéliumkivonatai minden vizsgált koncentrációban nem mutattak genotoxikus aktivitást (3(a) (A), 3(b) (A) és 3(c) (A) ábra). Minden micéliumkivonat és koncentráció jelentős antigenotoxikus hatást mutatott a H2O2 által kiváltott DNS-károsodással szemben, mind az elő-, mind az utókezelés során, és ezek az aktivitások nem különböztek jelentősen. A T. versicolor esetében a legalacsonyabb kivonat-koncentrációnál kissé alacsonyabb aktivitás volt megfigyelhető. A T. hirsuta esetében az 5,0, 2,5 és 20,0 mg mL-1 koncentrációk voltak hatékonyabbak, míg a T. gibbosa esetében a legnagyobb védőhatás 2,5 mg mL-1 koncentrációnál volt megfigyelhető, a legkisebb pedig 20,0 mg mL-1 koncentrációnál (3. a) (B, C), 3. b) (B, C) és 3. c) (B, C) ábrák).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Néhány mutagén és karcinogén vegyület van jelen különböző természetes forrásokban . Másrészt egyes természetes vegyületek a koncentrációtól és az expozíció időtartamától függően lehetnek genotoxikus és/vagy citotoxikus hatást okozó prooxidánsok vagy antioxidánsok . A nagy táplálkozási és gyógyászati értékű gombafajok in vitro és in vivo hatásai eltérőek lehetnek az emésztési körülmények közötti instabilitásuk vagy a gyomor-bél traktus általi felszívódási képtelenségük miatt . Az in vitro kapott aktivitások ugyanis nem feltétlenül felelnek meg az in vivo tapasztaltaknak. Azt is fontos hangsúlyozni, hogy a gombakivonatok genotoxikus és antigenotoxikus hatásai függenek a fajtól, a koncentrációtól és az értékelésükhöz használt vizsgálattól . Így eredményeink a három Trametes faj eltérő képességét mutatták a H2O2 által kiváltott DNS-károsodás csökkentésére; például a T. hirsuta termőtest-kivonatában észleltük a legalacsonyabb aktivitást. Egyértelmű fordított dózis-válasz összefüggést a DNS-károsodás szintje és a kivonat koncentrációja között csak a T. hirsuta basidiocarp kivonatában észleltünk. A T. versicolor és a T. gibbosa esetében azonban a kivonat koncentrációjának az optimális dózis feletti növelése nem vezetett a comet-eredmények javulásához, ami megerősíti a Miyaji és munkatársai eredményeit. Ezek a szerzők kimutatták, hogy nincs dózis-válasz kapcsolat a Lentinus edodes kivonat koncentrációja és antigenotoxikus hatása között. Fontos megemlíteni, hogy a kivonatok kombinált fenolos, flavonoid és egyéb összetevőinek nagyobb potenciállal kell rendelkezniük, mint a kivonatok egyes összetevőinek, ami az összes összetevő együttes hatásának jelentőségére utal. Ez a megállapítás a Trametes spp. antigenotoxikus aktivitásának eltérő tendenciáját eredményezheti. A kivonat genotoxikus aktivitásának a vizsgálat típusától való függését Morales és munkatársai bizonyították ; azaz a Lactarius deliciosus, Boletus luteus, Agaricus bisporus és Pleurotus ostreatus bazídiumkárp kivonatok mutagén hatásának hiányáról számoltak be emlőssejteken az Ames Salmonella/mikroszóma teszt segítségével. Ugyanakkor a P. ostreatus kivonat gyenge aktivitást mutatott a CHO/HPRT teszttel.
A gombakivonatok antigenotoxikus hatásának mögöttes mechanizmusai még mindig nem teljesen ismertek. Úgy tűnik, hogy a kivonatok védőhatása egynél több hatásmechanizmuson alapul, ami Gebhart szerint nem szokatlan a gombák esetében. Az antigenotoxikus mechanizmusokat elő- és utókezelések, azaz a kivonatok és a H2O2 különböző kombinációinak alkalmazásával lehetett értékelni. Pozitív eredményeink mindkét kezelésben azt jelzik, hogy a kivonatok védőhatással rendelkeznek mind a megelőzés, mind a beavatkozás szintjén, és desmutagénként és bioantimutagénként működhetnek, amit korábbi vizsgálatok is bizonyítottak . Az előkezelés hatékonysága, amelyet a jelen vizsgálatban megfigyeltünk, a sejtek antioxidáns kapacitásának növelésével magyarázható, azaz az antioxidáns enzimek szintézisének és aktivitásának serkentésével az oxidatív stressz indukciója során . Az utókezelés pozitív hatása a beavatkozási tevékenységek szinergikus hatásának eredménye lehet a szabad gyökök elszívásán és az antioxidáns enzimek stimulálásán keresztül, valamint a DNS-javítás gerjesztésén keresztül, ahogyan azt Chiaramonte és munkatársai javasolták . Mivel ezek a szerzők 30-60 perc oxidatív ágensnek való expozíció után jelentős DNS-károsodás-javításról számoltak be, arra lehet következtetni, hogy a DNS-javítás kevésbé jelentős szerepet játszott a H2O2 elleni védelemben, mivel a kezelést követő körülmények legfeljebb 30 perces inkubációt vettek figyelembe. Ezért a Trametes spp. kivonatok genoprotektív aktivitása valószínűleg antioxidáns hatáson alapul. Másrészt ismert, hogy az eukarióta szervezetek a genomiális inzultusok elleni védelemre kifejlesztettek egy jelátviteli útvonalat, az úgynevezett DNS-károsodási választ. Gasser és Raulet kimutatták, hogy a DNS-károsodási válasz riasztja az immunrendszert azáltal, hogy az aktiváló immunreceptor NKG2D sejtfelszíni ligandumainak expresszióját indukálja, amelyet a természetes ölősejtek (NK-sejtek) és egyes T-sejtek fejeznek ki. Ezért a Trametes spp. genoprotektív aktivitása a genotoxikus anyagoknak kitett sejtekben módosíthatja a DNS-károsodási választ és gátként működhet a korai tumorigenezisben. A további kutatásoknak ki kell terjedniük a Trametes spp. kivonatokkal kezelt limfociták szuperoxid-dizmutáz és kataláz szintjének elemzésére, mind a H2O2-vel történő kezelés előtt, mind utána, annak érdekében, hogy megerősítsék azt a feltételezést, hogy a sejtek antioxidáns kapacitásának fokozását ezek a kivonatok indukálják.
3.3. Az antioxidáns-kapacitás növelése a sejtekben. Antioxidáns aktivitás
A vizsgált etanolos kivonatok jó antioxidánsok voltak, de aktivitásuk a fajoktól függött. A termőtest kivonatok szignifikánsan nagyobb scavenging hatást mutattak, mint a micélium kivonatok (). A legmagasabb DPPH gyökfogó aktivitást a T. versicolor kivonatokban mutatták ki, mind a termőtest, mind a micélium esetében (63,5%, illetve 59,4%), amit az EC50 értékek (15,22 mg ml-1, illetve 16,18 mg ml-1) is megerősítettek. A T. hirsuta kivonatok esetében valamivel alacsonyabb aktivitási szintet találtunk (59,0% a bazídiumtestek és 46,8% a micélium esetében), amelyek 17,06 mg mL-1 és 21,81 mg mL-1 koncentrációja a gyökök 50%-os csökkentését biztosította. A T. gibbosa volt az a faj, amelynek a legalacsonyabb volt a gyökfogó potenciálja, különösen a micélium kivonatoké (39,7%), 26,15 mg mL-1 EC50 értékkel. A termőtest kivonatának gyökfogó képessége azonban nem volt jelentősen alacsonyabb a másik két fajhoz képest (53,7% és 18,13 mg mL-1 EC50 érték). A szintetikus antioxidáns BHA gyökfogó aktivitása 94,28% volt, és 0,10 mg mL-1 koncentráció 50%-os csökkentést biztosított.
A Trametes fajok termőtest- és micéliumkivonatainak teljes fenoltartalma szignifikánsan különbözött () (1. táblázat). Általában a termőtest-kivonatok fenoltartalma magasabb volt, mint a micélium-kivonatoké.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
A T. versicolor basidiocarp és a T. versicolor micélium kivonatai voltak a leggazdagabbak fenolokban és flavonoidokban, míg a T. gibbosa kivonatokban mértük a legalacsonyabb koncentrációkat. A fenol- és flavonoidkoncentrációk alapján a T. hirsuta kivonatok a másik két faj kivonata között helyezkedtek el (1. táblázat). A kivonatok scavenging aktivitása és a fenol- és flavonoidtartalom közötti korreláció mértéke magas volt, a termőtestek esetében 0,98 és 0,99, a micélium esetében pedig 0,97 és 0,99.
A Trametes fajok antioxidáns potenciáljára korábbi tanulmányok is utaltak. Így Kamiyama és munkatársai kimutatták, hogy a kivonat koncentrációja még 0,5 mg mL-1 is közel 50% -át elkapta az oldószertől függően, míg Johnsy és Kaviyarasana a T. gibbosa basidiocarps metanolos kivonatával 1,0 mg mL-1 koncentrációban még 91,5% -os gyökcsökkentést figyeltek meg. A vizsgálatunkban vizsgált etanolos kivonatok kapacitása kissé alacsonyabb, de magasabb volt, mint a Sheikh et al. által elemzett etanolos T. hirsuta termőtest kivonatoké .
Mau et al. és Palacios et al. szerint a fenolos vegyületek kulcsszerepet játszanak az antioxidatív aktivitásban. Ezek a vegyületek nagyon gyakoriak és fontos alkotórészei a gombák termőtestének és micéliumának. Képességük a hidroxilcsoportok jelenlétén alapul, amelyek redukálószerként, fémkelátorként, szingulett oxigén csillapítóként és hidrogéndonorként működnek. Néhány esetben azonban aktivitásuk nem tulajdonítható a kivonatok teljes fenoltartalmának, amit megerősít a mi eredményeink összehasonlítása Johnsy és Kaviyarasana eredményeivel . Nevezetesen, a T. gibbosa basidiocarp kivonat 23,8 μg GAE mg-1 kivonatot tartalmazó 91,5%-át redukálta, míg a BEOFB 310 törzs 20,07 μg GAE mg-1 kivonat fenolkoncentrációjú kivonata csak 63,5%-ban fosztotta meg a gyököket. A szerb T. gibbosa törzs flavonoid-koncentrációja azonban jelentősen magasabb volt a Johnsy és Kaviyarasana által vizsgált törzséhez képest (7,63 μg QE mg-1 kivonat, illetve 0,59 μg QE mg-1 kivonat), és ez az oldószerek különböző polaritásával, valamint a törzs eltérő flavonoidszintézis-kapacitásával magyarázható .
4. Következtetés
A vizsgálat volt az első kísérlet a T. versicolor, T. hirsuta és T. gibbosa kivonatok DNS-védő aktivitásának értékelésére, és annak meghatározására, hogy ez az antioxidáns potenciáljukon alapul-e . Az eredmények arra utalnak, hogy e három faj kivonatai erős antigenotoxikus szereknek tekinthetők, amelyek képesek stimulálni a sejtek genoprotektív válaszát, hozzájárulva a fokozott immunfunkcióhoz, a toxinok eltávolításához és megerősítéséhez, ami a hagyományos felhasználásra utal. Azonban további vizsgálatok szükségesek az antigenotoxikus aktivitás specifikus hordozóinak és a DNS oxidatív károsodással szembeni védelmének módjának feltárásához.
Érdekellentét
A szerzők kijelentik, hogy nincs érdekellentétük a cikk publikálásával kapcsolatban.
Köszönet
A szerzők köszönetet mondanak Dr. Steve Quarrie professzornak, a Newcastle-i Egyetem (Egyesült Királyság) vendégprofesszorának az angol nyelv átdolgozásáért és javításáért. Ez a tanulmány a Szerb Köztársaság Oktatási, Tudományos és Technológiai Fejlesztési Minisztériumának 173032. számú és 173034. számú projektjének pénzügyi támogatásával készült.
Vélemény, hozzászólás?