Výsledky a diskuse

Celková struktura TE domény. Ačkoli struktura izolované domény TE, která byla vyřešena, představuje dvě nezávislé molekuly (1 a 2) v asymetrické jednotce (tabulka 1), doména byla purifikována a plně aktivní jako monomer (Z.G. a B.C., nepublikované údaje). Nativní lidská FAS je uspořádána jako antiparalelní homodimer s hlavou k ocasu (1), jak bylo nedávno vizualizováno na mapách elektronové kryo-mikroskopie (kryo-EM) (31). Toto uspořádání by umístilo dvě TE domény monomerů FAS na opačné konce od sebe, což nepropůjčuje tvorbě dimeru žádný funkční význam. Z těchto důvodů je dimer artefaktem krystalizace. Za reprezentativní strukturu je dále považována struktura molekuly 1.

Doména TE lidského FAS se skládá ze dvou subdomén (A a B) (obr. 1). Větší subdoména A (≈23 kDa) je tvořena dvěma nesouvislými segmenty z amino- (neboli N-) a karboxylového (neboli C-) terminálního konce (obr. 1, 2, 3). Intervenující segment je vyhrazen menší (≈9 kDa) subdoméně B. Subdoména A má celkovou α/β skladbu, zatímco subdoména B má zcela α-helikální motiv. Celá struktura se skládá z devíti α-šroubovic a osmi β-vláken (obr. 1 a 2). Většinu celé struktury TE domény bylo možné vměstnat do elektronové hustoty, s výjimkou tří segmentů a glycinového zbytku zobrazených na obr. 1, 2, 3, u nichž hustota chybí nebo je slabá, což svědčí o jejich vysoké pohyblivosti. Všechny neuspořádané segmenty se nacházejí v rozpouštědlu exponovaných oblastech a nikde se neblíží zapojení do krystalových kontaktů.

Tři katalytické zbytky lidské TE FAS (Ser-2308, His-2481 a Asp-2338) jsou mezi sebou a sousedními zbytky spojeny rozsáhlou sítí vodíkových vazeb (obr. 4). Hydroxylová skupina Ser-2308 je zapojena do kooperativní vodíkové vazby, akceptuje ze sousední amidové páteře Tyr-2309 a daruje Nε2 His-2481. To by zase usnadnilo aktivaci Ser-2308 jako nukleofilu a pomohlo stabilizovat oxyaniontový tetraedrický meziprodukt, který by měl vzniknout během TE katalytické reakce, jak je vidět u serinhydrolas. Zbytek His-2481 (Nε2) je zase vodíkově vázán na Asp-2338 (Oδ2). Asp-2338 (atom Oδ1) vytváří další vodíkové vazby s amidem páteře Ala-2448 a hydroxylovou skupinou Tyr-2462. Tyr-2462 je zcela invariantní, zatímco Ala-2448 je částečně konzervován od hmyzu po savce (obr. 3). Zdá se tedy, že interakce mezi těmito zbytky a katalytickým aspartátovým zbytkem je důležitá pro udržení Asp-2338 v jeho konkrétní poloze, což dále naznačuje důležitou roli, kterou tento zbytek hraje. Rozsáhlá síť vodíkových vazeb v katalytickém místě udržuje enzym připravený k činnosti tím, že orientuje a umisťuje katalytické zbytky do jejich požadovaných pozic, podobně jako je tomu u serinových hydrolas (40).

Specifičnost místa vazby palmitoylového řetězce a délky řetězce. Abychom pochopili mechanismus, kterým TE doména FAS reguluje specifitu délky řetězce, analyzovali jsme strukturu TE z hlediska přítomnosti drážky v blízkosti katalytického centra, která by mohla pojmout substráty s dlouhým mastným acylovým řetězcem. Je patrná přítomnost pouze jedné drážky, která se nachází na rozhraní mezi subdoménami A a B (obr. 5). Analýza pomocí programu proshape (viz Materiály a metody) potvrdila přítomnost drážky o objemu 186,9 Å3 a ploše 140 Å2, jejíž distální konec tvoří kapsu (obr. 5). Drážka se nachází v blízkosti aminoterminálu domény TE, která je spojena s doménou ACP FAS, která zadržuje rostoucí acylové řetězce pro skenování a uvolnění doménou TE po dosažení optimální délky řetězce mastné kyseliny 16 uhlíků. Většina zbytků, které lemují drážku, pochází z amfifilního šroubovice α8 subdomény B. Další zbytky, které do ní přispívají, jsou ze šroubovice α5 subdomény B, N-koncové šroubovice α1 subdomény A a smyčky mezi β2 a α2 subdomény A. Zbytky lemující drážku, které jsou většinou hydrofobní povahy, se skládají z Phe-2418, Ala-2419, Ser-2422, Phe-2423 a Lys-2426 z helixu α8, Phe-2370 a Phe-2371 z helixu α5, Leu-2222, Leu-2223 a Val-2224 z helixu α1 a Ile-2250 a Glu-2251 ze smyčky mezi β2 a α2 (obr. 5A ). Z těchto zbytků jsou Ile-2250, Glu-2251 a Lys-2426 neměnné napříč druhy, zatímco Val-2224, Phe-2371, Ala-2419 a Phe-2423 jsou většinou konzervované (obr. 3). Zbytek zbytků je u savců zcela konzervován (obr. 3). Všechna výše uvedená pozorování dohromady naznačují, že rozhraní mezi oběma subdoménami je vynikající oblastí pro vazbu řetězců mastných kyselin. Byly provedeny dva experimenty, které měly tomuto předpokladu dodat věrohodnost a získat vhled do selektivity řetězců mastných acylů

Obr. 5.

Vazné místo pro lipidy. (A) Stereopohled na kandidátní palmitoylovou vazebnou drážku pro prvních 11-12 uhlíků a kapsu pro posledních 5-4 uhlíky. Hexadecylsulfonylový inhibitor je znázorněn jako Corey-Pauling-Koltunův model vyplňující prostor (C, žlutá; O, červená; S, zelená). Boční řetězce lemující drážku jsou znázorněny jako kulové postavy (C, žlutá; O, červená; N, modrá). Boční řetězce tvořící aktivní místo jsou rovněž znázorněny jako obrázky ve tvaru koule a tyče s podobným barevným schématem jako zbytky. Mapa povrchu drážek je znázorněna zelenou drátěnou sítí. Zbytky tvořící drážku jsou označeny s výjimkou Ile-2250, který není vidět, protože spadá pod inhibitor. Počátečních 11-12 atomů uhlíku ze sulfonylové skupiny je exponováno rozpouštědlem, přičemž 11. a 12. atom uhlíku je v ústí kapsy. (B) Jiný pohled na drážku a kapsu. Šipky označují rotace při přechodu z orientace pohledu v A do B. Tento pohled ukazuje, že většina mastného acylového řetězce hexadecylového inhibitoru je vystavena rozpouštědlu.

Nejprve jsme pomocí místně řízené mutageneze prokázali, že záměny několika zbytků lemujících drážku a kapsu domény TE snižují aktivitu TE, i když v různé míře (tabulka 2).

Zobrazit tuto tabulku:

  • Zobrazit inline
  • Zobrazit popup

Tabulka 2. Mutace v kandidátním vazebném žlábku snižují aktivitu TE

Druhé jsme byli schopni modelovat vazbu inhibitoru obsahujícího C16 palmitoylový řetězec hexadecyl sulfonyl f luorid (HDSF) do žlábku. Modelování bylo vedeno údaji z krystalové struktury palmitoylového proteinu TE 1 (PPT1) s kovalentně vázaným hexadecylsulfonátem (HDS) (PDB ID kód 1exw; cit.41 ) a rozšířeno o energetickou minimalizaci v cns. Stejně jako TE obsahuje katalytické místo PPT1 konzervovanou katalytickou triádu serinu, histidinu a aspartátu. Struktura komplexu PPT1-HDS ukázala vznik kovalentní vazby mezi atomem síry HDS a atomem kyslíku katalytického serinu a přítomnost mastného acylového řetězce v dlouhé převážně hydrofobní povrchové rýze proteinu (41). Modelovaný kovalentně vázaný HDS ve struktuře TE (zobrazené na obr. 5) odhalil několik rysů vazby ligandu s důležitými funkčními a biochemickými důsledky. Fitování HDS nezpůsobilo žádnou významnou změnu uspořádání zbytků ve vazebném místě. Palmitoylový řetězec vytváří ostrý ohyb vzhledem k sulfonátové skupině podobně jako ve struktuře vázaného PPT1. Palmitoylový řetězec o 16 atomech uhlíku dobře zapadá do drážky, přičemž prvních ≈12 atomů uhlíku je vystaveno rozpouštědlu a zbývající ≈4 atomy uhlíku jsou vloženy a drženy v distální kapse. Toto umístění plně odpovídá pozorování, že savčí FAS TE katalyzuje tvorbu kyseliny palmitové jako svého hlavního produktu (20). Přítomnost posledních ≈4 atomů uhlíku v kapse pomáhá udržet řetězec mastné kyseliny na místě pro hydrolýzu palmitoyl acylového substrátu. Povaha vazebného místa, které kombinuje obnaženou drážku s uzavřenou kapsou, je jedinečná a určená pro specifičnost této TE. Zjištění, že TE doména savčích FAS nevykazuje významnou aktivitu vůči mastným acylovým řetězcům kratším než 14 atomů uhlíku (20), lze vysvětlit neproduktivní vazbou v důsledku chybějící vazby a z toho vyplývající větší pohyblivosti exponovaných kratších řetězců. Poslední ≈4 atomy uhlíku palmitoylového řetězce částečně zabírají distální kapsu, takže zbývá dostatek místa pro umístění pouze 2 dalších atomů uhlíku. Tento výsledek je v souladu s dramatickou ztrátou aktivity pozorovanou u modelových substrátů delších než 18 atomů uhlíku (20). Není jasné, zda poslední atomy uhlíku ≈4 a ≈6 mastných acylových řetězců C16 a C18 budou vloženy do předem vytvořené kapsy mezi oběma subdoménami, jak je vidět ve struktuře nevázané formy, nebo budou zpočátku vázány na otevřenou formu domény, která pak následně projde pohybem ohybu závěsu mezi subdoménami, aby uzavřela koncové atomy uhlíku mastných acylových řetězců a vytvořila produktivní konfiguraci oblasti aktivního místa.

Bylo vynaloženo značné úsilí na krystalizaci TE s různými analogy mastných kyselin s dlouhým řetězcem (např, palmitoyl-CoA, myristoyl-CoA, stearoyl-CoA, kyselina palmitová, hexadecylsulfonylfluorid a kyselina palmitová), ale nebyly nalezeny žádné dlouhodobě stabilní komplexní struktury. Většina komplexů, jak ukázaly nezávislé testy enzymové aktivity nebo radioaktivní vazby v roztoku, disociovala během 5 min až 1 h, což je činí nevhodnými pro krystalizaci nebo pokusy s namáčením krystalů.

Cryo-EM Fit of TE Structure. Ačkoli byla popsána 20-Å rekonstrukční struktura kryo-EM lidského dimeru FAS (31), nebyl zjištěn žádný údaj o N- až C-koncové polaritě podjednotky FAS s výjimkou předchozího údaje ze značení protilátkami, že se TE doména FAS nachází na jednom z konců celé struktury (42). Pokusili jsme se o předběžné posouzení polarity ručním dokováním menší (32 kDa) struktury lidské FAS TE domény, která zaujímá C-konec podjednotky FAS, a větší (42 kDa) E. coli β-ketoacyl syntázy I (neboli KSI) krystalové struktury (PDB ID kód 1ek4) (43), která je blízkým homologem N-koncové KS domény savčí FAS, do obou konců monomerní jednotky označené jako hlava a noha hmotnostní hustoty kryoEM (obr. 6). Struktura TE dobře zapadá do konce substruktury označené noha, zatímco KSI nejlépe zapadá do konce substruktury označené hlava (obr. 6). V dimeru FAS doména ACP interaguje jak s doménou TE téhož monomeru, tak s doménou ketoacylsyntázy v opačném monomeru, což vede k vytvoření dvou aktivních center na obou koncích dimeru. Orientace TE domény a homologu KS domény pro nejlepší uložení u paty, respektive hlavy, vyhovovala jak prostorově, tak funkčně interakci molekuly ACP s oběma proteiny. Když byly struktury prohozeny, fitování bylo mnohem horší, přičemž některé části KSI spadaly mimo hustotu a v TE fitování byl větší objem nezapočítané hustoty (obr. 6).

Obr. 6.

Předběžný fit TE (zelená páteřní stopa) a KSI (kaštanová stopa) v hmotnostní hustotě kryoEM s rozlišením 20Å. Substruktury patrné z hustoty jsou označeny jako Hlava, Torzo a Noha. Stopa TE nejlépe odpovídá substruktuře označené Foot, zatímco páteřní stopa KSI nejlépe odpovídá substruktuře označené Head. Nejlepší fit pro KSI i TE je zakroužkován červeně. Páteřní stopy TE a KSI v dolní části hustoty hmotnosti vykazují méně uspokojivé shody v substruktuře hlava, resp. noha. Na základě předchozích experimentů s proteolytickým štěpením intaktního FAS byly identifikovány tři domény: doména I, která zahrnuje enzymová centra KS-AT/MT-DH a linkerovou oblast, doména II, která zahrnuje oblast ER-KR-ACP, a doména III, která je přiřazena TE (1, 2). Substruktury Head a Torso, které jsou v podstatě koalescentní, by mohly odpovídat doméně I a části domény II a Foot by mohla představovat zbytek domény II a doménu III.

Závěry. Hlavní závěry, které lze vyvodit z krystalové struktury TE domény lidského FAS, jsou následující. (i) TE se skládá ze dvou subdomén, které se liší velikostí a motivy skládání. (ii) Větší subdoména A vykazuje motiv α/β, zatímco menší subdoména B je celá šroubovicová. (iii) Subdoména A přispívá katalytickou triádou zbytků Ser, Asp a His. (iv) Dlouhá drážka s distální kapsou mezi subdoménou B a částí subdomény A tvoří vazebné místo pro mastný acylový řetězec. Geometrie a povaha tohoto místa odpovídají vysoké specifičnosti TE vůči substrátům mastných acylů C16 až C18. Drážka funguje jako pravítko, které odměřuje správnou délku substrátu. (v) Předběžné napasování TE na intaktní kryoEM strukturu lidské FAS naznačuje pravděpodobnou polaritu N až C terminálu podjednotek. Pro další ověření shody a hloubkovou analýzu funkce FAS je však zapotřebí kryo-EM mapa s vyšším rozlišením

.