Srovnání imunohistochemie a Western blotu

By Sarah Moore, M.Sc.Reviewed by Michael Greenwood, M.Sc.

Imunohistochemie i Western blot fungují na principu specifické vazby protilátek na antigeny přítomné v biologické tkáni.

Obrázek: Sinitar/.com

Immunohistochemie je nejběžnější z technik imunobarvení. Zviditelňuje přítomnost cílových antigenů ve vzorku tkáně pomocí protilátek, které se na antigeny naváží, mají katalytický účinek a rozštěpí molekulu na identifikovatelné sloučeniny. Vizualizace této interakce lze dosáhnout použitím enzymu (vytváří chromogenní signál) nebo fluoroforu (vytváří fluorescenční signál).

Western blot pracuje na stejném principu. Poprvé byl popsán již v 70. letech 20. století, kdy jej vědci poprvé použili k úspěšné klasifikaci různých proteinů existujícíchv biologické tkáni. Od té doby došlo k významnému pokroku v této technologii, který vedl k zavedení moderní fluorescenční, kolorimetrické a chemiluminiscenční techniky Western blot.

Všechny verze metody Western blot se spoléhají na fungování komplexu antigen-protilátka při identifikaci specifických proteinů přítomných ve vzorku, indikovaných buď reakcí enzymu a substrátu kolorimetrických, chemiluminiscenčních nebo fluorescenčních molekul. Ze světla produkovaného těmito zdroji lze usuzovat na přítomnost a koncentraci proteinů ve vzorku.

Srovnání technik

Ačkoli obě metody vycházejí z principu interakce protilátka-antigen, existují mezi nimi některé zásadní rozdíly. Níže je rozebereme krok za krokem.

Předně, pro obě techniky musí být vzorek správně připraven. Příprava se mezi oběma metodami poměrně výrazně liší. Pro imunohistochemii se vzorky tkáně krájejí nebo ponechávají vcelku v závislosti na jejich velikosti.

Hranice velikosti vzorků se obecně pohybuje od 3 µm do 5 µm. Poté se vzorky vloží do média, obvykle do parafínu nebo kryomédia. Následně se řezy umístí na podložní sklíčka a dehydratují se pomocí stále silnějších alkoholových promývaček, na závěr se přidá detergent, aby se vzorek vyčistil a byl připraven k prohlížení pod mikroskopem.

Na druhou stranu Western blot vyžaduje, aby byly vzorky nejprve separovány elektroforézou a poté imobilizovány v blotovací membráně.

Způsob barvení vzorků se u obou technik také mírně liší. Imunohistochemie přidává buď polyklonální, nebo monoklonální protilátky. Tyto protilátky jsou klasifikovány buď jako primární, nebo sekundární činidla, přičemž první z nich jsou ty, které jsou zvýšeny proti cílovému antigenu a jsou obvykle nekonjugované, druhé jsou konjugované s linkerovou molekulou, která pak nabírá reportérové molekuly.

Konjugovaná verze se používá v metodě přímého barvení, kdy protilátka přímo reaguje s antigenem ve vzorku, nekonjugovaná verze se používá v metodě nepřímého barvení, kdy se neznačená protilátka váže na cílový antigen ve tkáni a způsobuje reakci sekundární protilátky s primární protilátkou.

Pro srovnání, při metodě Western blot se do vzorku přidá fluorescenční barvivo a následně se vystaví světelnému zdroji příslušné vlnové délky, který excituje molekuly fluoroforů.

Po určité době excitované fluorofory nakonec uvolní energii, kterou získaly ze světelného zdroje, a vrátí se do základního stavu. Díky tomuto uvolnění energie fluorofory fluoreskují a vyzařují světelný zdroj, který lze zachytit digitálním zobrazovacím zařízením.

Porovnání výhod a nevýhod

Hlavní výhodou imunohistochemie je, že tato metoda umožňuje výzkumníkům zjistit přesné umístění cílového proteinu ve vzorku tkáně. Tato hlavní výhoda vedla k tomu, že se v oblasti neurověd prosadila jako spolehlivá metoda pro zkoumání exprese proteinů v cílových místech mozku.

Na druhou stranu má tato metoda ve srovnání s metodou Western blot jednu zásadní nevýhodu. Tou je skutečnost, že se barvení nekontrolují podle žebříčku molekulových hmotností, jako je tomu u Western blotu, což znamená, že není možné prokázat, že barvení prokázané v imunohistochemii se jednoznačně vztahuje ke konkrétnímu proteinu.

Nepřímá metoda imunohistochemie je uznávána jako vysoce citlivá, avšak přímá metoda je známá svým opakem a obecně není schopna detekovat malé koncentrace cílových antigenů.

Metoda Western blot je výhodná v tom, že se prosadila jako spolehlivá technika pro shromažďování kvantitativních údajů. Její nejvýznamnější výhodou však je, že se ukázala jako účinná při generování signálu, který je úměrný množství proteinu, který se vyskytuje ve vzorku.

Metoda Western blot je také často volena pro svou schopnost detekovat mnoho cílových proteinů současně, což má za následek výrazné zkrácení doby testování a také snížení počtu potřebných zdrojů.

Rozdíl v aplikacích

Použití obou technik se vzhledem k jejich podobnosti do značné míry překrývá. Celkově se však na imunohistochemii spoléhá především jako na diagnostický nástroj u řady nádorových onemocnění.

Metoda se používá k identifikaci abnormálních buněk, které jsou charakteristické pro určité nádory. Metoda se také široce používá k identifikaci a lokalizaci proteinů a biomarkerů, které se nacházejí v normálních i nemocných tkáních. V neposlední řadě se také běžně používá k detekci četných infekčních organismů v tkáních.

Pro srovnání, Western blot se většinou používá k detekci autoimunitních onemocnění, alergií a infekčních onemocnění. Je široce používán v oblasti molekulární biologie, biochemie a buněčné biologie, přičemž jeho nejvýznamnější aplikace se používají jako diagnostický nástroj pro HIV a BSE.

Další čtení

• Všechen obsah o imunohistochemii
• Immunohistochemie (IHC) Zobrazovací techniky
• Enzymatická imunohistochemie (IHC)
• Vícebarevná imunohistochemie (IHC)
• Jak funguje imunochemie?

Napsal

Sarah Moore

Po studiu psychologie a poté neurovědy Sarah rychle objevila své potěšení pro výzkum a psaní výzkumných prací; změnilo se ve vášeň spojovat myšlenky s lidmi prostřednictvím psaní.

Citace

.