Rychlá laterální průtoková imunoanalýza pro fluorescenční detekci RNA SARS-CoV-2

V systému HC-FIA zesilují FNP s DNA sondou signál hybridizace virové RNA a DNA v sondě. Princip konstrukce biosenzoru HC-FIA je znázorněn na obr. 1.

a, Princip HC-FIA. b, Reprezentativní výsledky na proužku s bočním průtokem. c, Zařízení pro fluorescenční analýzu. d, Fotografie přenosné kufříkové laboratoře, která má délku 55,5 cm, šířku 37 cm a výšku 23 cm a hmotnost 8,5 kg. e, Proces testování testu HC-FIA. Krok 1: hybridizace nukleové kyseliny v inkubátoru při konstantní teplotě. Krok 2: stanovení intenzity fluorescenčních signálů na testovací kartě pomocí zařízení uvedeného v bodě c. f, Distribuce sondy v genomu SARS-CoV-2.

Konstrukce a fungování testu HC-FIA

Myší S9.6 monoklonální protilátky jsou prefixovány na testovací linii (T) laterálního průtokového proužku a kontrolní linie (C) je potažena polyklonálními protilátkami kozí proti králičímu IgG (obr. 1a). Do reakční zkumavky se vloží FNP značené protilátkami S9.6 a králičím IgG. Na začátku detekčního procesu se SARS-CoV-2 ve vzorku výtěru z krku nebo sputa lyzuje a uvolňuje a uvolněná RNA hybridizuje se specifickou sondou SARS-CoV-2 DNA. Vzniklý hybrid RNA-DNA je zachycen protilátkami S9.6 značenými FNP a komplex pod vlivem kapilárních sil proudí po podložce vzorku a nitrocelulózové membráně směrem k absorpčnímu papíru. Při průchodu oblastí T je komplex zachycen protilátkami S9.6 a postupně vytváří fluorescenční signál. V oblasti C je králičí IgG značený FNP zachycen anti-králičím IgG. Přítomnost nebo nepřítomnost cílové SARS-CoV-2 RNA je založena na hraniční hodnotě intenzity fluorescence (obr. 1b,c). Obrázek 1d ukazuje přenosnou kufříkovou laboratoř, která má schopnost poskytnout kvalitativní výsledky za méně než hodinu po následujících dvou krocích: hybridizaci a imunofluorescenční analýze (obr. 1e).

Použili jsme poměr testovacího fluorescenčního signálu ke kontrolnímu fluorescenčnímu signálu (T/C) na proužku laterálního toku tak, aby byl minimalizován vliv případné fluorescence pozadí testovací karty. Měřením poměru T/C u vzorků výtěrů z krku od 211 zdravých jedinců jsme zjistili, že průměrný poměr pozadí T/C byl 49,95 s d.s. 17,16 (doplňkový obr. 1a). K určení mezní hodnoty a posouzení diagnostické přesnosti testu HC-FIA na základě citlivosti a specifičnosti při různých prahových hodnotách byla použita křivka ROC (receiver operating characteristic) a plocha pod křivkou (AUC). Křivku ROC s AUC 0,999 s 95% intervalem spolehlivosti (CI) 0,997-1,000 (doplňkový obr. 1b) jsme stanovili na základě vzorků výtěrů z krku od 100 klinicky potvrzených a vyloučených případů COVID-19. Hraniční hodnota, která dosáhla nejvyšší senzitivity a specificity, byla stanovena na 102,07, což odpovídá bodu Youdenova indexu 0,980. Alternativně se jako mezní hodnota u imunoanalýz obvykle používá dvojnásobek hodnoty negativního pozadí (zde 49,95 × 2 = 99,90). Pro pohodlí jsme zvolili mezní hodnotu T/C 100,00.

Vývoj testuHC-FIA

Klíčem ke zlepšení účinnosti testu je optimalizace sond DNA pro cílovou sekvenci RNA viru SARS-CoV-2 . Seznam všech sekvencí sond DNA, které jsme navrhli, je uveden v doplňkové tabulce 1. Genom SARS-CoV-2 obsahuje přibližně 30 000 bází, včetně různého počtu (6-11) otevřených čtecích rámců (ORF). První ORF tvoří přibližně 67 % celého genomu a kóduje 16 nestrukturálních proteinů, jakož i pomocné proteiny a strukturální proteiny. Čtyři hlavní strukturní proteiny jsou hrotový glykoprotein (S), malý obalový protein (E), matrixový protein (M) a nukleokapsidový protein (N)15,16 . Většina testů detekce nukleových kyselin pro SARS-CoV-2 využívá následující tři konzervované oblasti virového genomu: ORF1ab, ve kterém se nachází gen pro RNA-dependentní polymerázu (rdrp)15 , a oblasti, které kódují N a E.

Začali jsme získáním sekvence genomu RNA viru SARS-CoV-2 z GenBank National Center for Biotechnology Information (NCBI) (přístupová čísla MN908947, MN908947.3, MN908947.2 a NC_045512.1). Podrobná analýza dalších publikovaných sekvencí genomu SARS-CoV-2 neodhalila v těchto oblastech žádné pozoruhodné odchylky. S pomocí návrhového softwaru Primer Premier 5.0 jsme navrhli tři sondy pro každou ze tří oblastí: CoV01 a CoV04, které se nacházejí v doporučené oblasti pro detekci ORF1ab a N, a CoV08, ve stejné oblasti jako E17. Pozice vazebných míst sond v sekvenci referenčního genomu (NC_045512.2) jsou uvedeny na obr. 1f.

Bylo provedeno zarovnání sekvencí mezi navrženými sondami DNA a sekvencemi z lidského genomu a z genomů virů, bakterií, mykoplasmy, chlamydií a dalších běžných patogenů. Sondy se shodovaly pouze s genomovou sekvencí SARS-CoV-2 a nenašli jsme žádnou homologii s lidskou genomovou DNA. Jako pozitivní kontroly byly použity pseudoviry nesoucí různé oblasti cílového genu zkonstruované pomocí lentivirů jako vektorů. Sekvence cílových genů použitých pseudovirů jsou uvedeny v doplňkové tabulce 2. P1 byl pozitivní pro oblast SARS-CoV-2 N, P2 pro oblast SARS-CoV-2 E a P3 pro oblast SARS-CoV-2 ORF1ab. Koncentrace tří pozitivních kontrol byla 3 000 transdukčních jednotek (TU) ml-1 , což znamená, že v jednom ml bylo 3 000 infekčních virových částic. Jako negativní kontroly N1-N17 byly použity fyziologický roztok, čištěná voda a vzorky stěrů z hltanu pozitivní na jiné běžné patogeny. Seznam informací o pozitivních a negativních kontrolách použitých ve studii je uveden v doplňkové tabulce 3. Výsledky testů jsou uvedeny v doplňkových tabulkách 4-6. Pro oblast ORF1ab byly vybrány sondy CoV01 a CoV03, pro oblast E byla vybrána sonda CoV08 a pro oblast N se na cílovou RNA přednostně vázaly sondy CoV04 a CoV06. Vybrané sondy DNA byly dále optimalizovány kombinací (doplňková tabulka 7), přičemž každá skupina sond cílila současně na všechny tři segmenty. Výsledky testu HC-FIA v doplňkové tabulce 8 ukazují, že kombinace sond Cov01, Cov04 a Cov08 (skupina 2) rozlišila všechny pozitivní kontrolní vzorky od negativních kontrol a detekovala pozitivní vzorky s nízkým virovým titrem (1 000 TU ml-1; doplňková tabulka 3, L1-L3) s pozitivitou vyšší než 95 %. Jako konečná kombinace byla proto vybrána skupina 2. K dnešnímu dni je v databázi NCBI zveřejněno 13 411 nukleotidových sekvencí SARS-CoV-2. Zarovnání tří sond s odpovídající cílovou oblastí v 13 411 nahraných sekvencích ukázalo, že cílové oblasti sond jsou natolik konzervované, že poskytují 100% podobnost.

Optimalizovali jsme také podmínky testování testu, zejména dobu inkubace pro hybridizaci a dobu odečítání testovacího proužku. Výkonnost testu pro inkubační doby 10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min a 60 min při 56 °C je uvedena v doplňkové tabulce 9. Všimněte si, že 20 min stačilo k hybridizaci sond DNA s cílovou oblastí, což se projevilo 100% pozitivitou při detekci pozitivních výtěrů z krku a vzorků sputa s nízkým virovým titrem (1 000 TU ml-1; doplňková tabulka 3, L1-L3). Při prodloužení inkubační doby na 50 nebo 60 min nebyla reakce tak stabilní, protože se snížila míra pozitivity referenčních vzorků L1-L3. S ohledem na účinnost detekce a požadavek na inaktivaci viru jsme jako inkubační dobu pro hybridizaci při 56 °C zvolili 30 min. Hodnotili jsme také dobu čtení proužku pro hodnoty 10 min, 12 min, 15 min a 18 min (doplňková tabulka 10). Výsledky ukázaly, že 12 min nebo delší doba vedla ke správné detekci pozitivních a negativních referenčních vzorků. Avšak variační koeficient (CV) byl nižší než 10 % pro detekci pozitivních vzorků s nízkým virovým titrem pouze při použití doby čtení 15 min. Proto jsme zvolili dobu čtení 15 min.

Guanidinium thiokyanát a guanidin chlorid – nejpoužívanější denaturanty proteinů pro extrakci nukleových kyselin – byly porovnávány jako transportní média pro uchování vzorků. Guanidinium thiokyanát vedl k lepšímu výkonu při rozlišování mezi pozitivními a negativními vzorky s relativně nízkým CV u vzorků s nízkým virovým titrem. Ve skutečnosti guanidinium-tiokyanát v koncentraci až 6 mol l-1 prokázal vynikající antivirové vlastnosti18. Jako proteinový denaturant pro inaktivaci viru v transportním médiu jsme zvolili guanidinium-tiokyanát v koncentraci 5 mol l-1.

Specifičnost testu HC-FIA

Po optimalizaci sekvencí sond a reakčních podmínek jsme zkoumali specifičnost testu HC-FIA pro detekci viru SARS-CoV-2.

Po optimalizaci sekvencí sond a reakčních podmínek jsme zkoumali specifičnost testu HC-FIA. Pozitivní kontroly zahrnovaly pseudoviry (vzorky P1-P3) s cílovými geny a pět klinických vzorků výtěrů z krku (vzorky P4-P8), potvrzených pomocí soupravy pro detekci nukleových kyselin založené na RT-qPCR (Shanghai ZJ Bio-Tech). Negativní kontroly, které se skládaly ze vzorků výtěrů z krku, byly potvrzeny jako negativní pro SARS-CoV-2 a pozitivní pro chřipku A, chřipku B, respirační syncytiální virus, chlamydii pneumoniae, adenovirus nebo jiné patogeny (vzorky N5-N17) nebo pseudovirus pozitivní pro oblast N MERS (vzorek N18) nebo SARS (vzorek N19). Seznam všech vzorků je uveden v doplňkové tabulce 3. Seznam výsledků detekce 8 pozitivních referenčních vzorků a 15 negativních referenčních vzorků je uveden v doplňkové tabulce 11.

Zkoumali jsme, zda existuje zkřížená reaktivita mezi SARS-CoV-2 a 55 běžnými patogeny, které způsobují respirační onemocnění. Zdroj a kvantitativní informace o každém patogenním mikroorganismu jsou uvedeny v doplňkové sadě dat 1. Původní titr viru byl stanoven na 106 jednotek tvořících plaky na ml pomocí plakového testu. U interferenčních vzorků bakterií, mykoplazmy a chlamydií byla úroveň koncentrace 107 kolonie tvořících jednotek na ml. Dále byla ze tří vzorků plné krve extrahována lidská genomová DNA a kvantifikována na 90-105 µg ml-1 . Test HC-FIA vykazoval vynikající specifitu pro SARS-CoV-2, bez zjevné zkřížené reaktivity se všemi ostatními vzorky patogenů a lidskou genomovou DNA (doplňkový soubor dat 1).

Jelikož se monoklonální protilátka S9.6 váže také na duplexy RNA-RNA19 , zejména bohaté na AU20 , navrhli jsme dvouřetězcové sekvence RNA s různým podílem AU. Podrobné informace o sekvencích jsou uvedeny v doplňkové tabulce 12. Jak ukazuje doplňková tabulka 13, bez ohledu na obsah AU nevykazoval test HC-FIA detekovatelný pozitivní signál vůči dvouřetězcové RNA, což naznačuje, že mezi protilátkou S9.6 a dvouřetězcovou RNA je za daných podmínek testu nízká vazebná afinita. Zkoumali jsme také, zda přítomnost dvouřetězcové RNA ovlivňuje výkonnost testu při detekci klinických výtěrů z krku nebo vzorků sputa. Použili jsme 2 pozitivní vzorky výtěru z krku, 2 pozitivní vzorky sputa, 10 negativních vzorků výtěru z krku a 5 negativních vzorků sputa. Měřili jsme poměry T/C s ohledem na hodnoty T/C testu bez interferencí a zjistili jsme, že se poměry pohybují mezi 0,9 a 1,1 (doplňková datová sada 1). To naznačuje, že přítomnost dvouvláknové RNA bez ohledu na obsah AU významně neovlivňuje výkon testu HC-FIA.

Citlivost a přesnost testu HC-FIA

Sériově jsme ředili vzorky pseudovirů obsahující tři úseky cílových genů na titry 5 000, 2 500, 1 000, 800, 500, 250 a 100 TU ml-1 a vypočítali průměrné hodnoty T/C pro 20 paralelních testů. Obrázek 2a ukazuje, že hodnoty meze detekce (LOD) pseudovirů pozitivních na oblasti N, E nebo ORF1ab SARS-CoV-2 byly již od 1 000 TU ml-1 s pozitivitou vyšší než 95 %. Když titry vzorků pseudovirů dosáhly 108 TU ml-1, nebyl pozorován žádný výrazný hákový efekt (doplňkový obr. 2). Lineární rozsah testu odpovídá titrům mezi 103 a 106 nebo 107 TU ml-1.

Svislé osy ukazují poměr intenzity fluorescence (T/C) testovacího signálu (T) a kontrolního signálu (C). Pro každou koncentraci bylo paralelně provedeno 20 testů. LOD byla stanovena jako koncentrace, při které byla míra pozitivity větší nebo rovna 95 %. a, poměry T/C pro sériově ředěné vzorky pseudovirů pozitivních na oblasti N, E a ORF1ab SARS-CoV-2. b, poměry T/C pro sériově ředěné vzorky výtěrů z krku od tří kriticky nemocných pacientů. Údaje jsou průměrné ± s.d.

Vzorky výtěrů z krku od tří kriticky nemocných pacientů – u nichž byla pomocí RT-qPCR zjištěna pozitivita na SARS-CoV-2 a virová zátěž byla kvantifikována pomocí digitální PCR – byly smíchány s negativními vzorky výtěrů z krku a připraveny sériové ředění 2000, 1000, 500, 400 a 250 kopií na ml. Jak ukazuje obr. 2b, LOD byla 500 kopií na ml s pozitivitou vyšší než 95 %. K ověření LOD byly použity klinické vzorky výtěrů z krku s hodnotami T/C blízkými kritické hodnotě (100) pro pozitivitu (vzorky s 512, 489 a 497 kopiemi na ml oblasti ORF1ab podle digitální PCR) (testy provedeny 20krát paralelně). Míra pozitivity těchto vzorků byla vyšší než 95 % (doplňkové tabulky 14-16).

Pro vyhodnocení přesnosti soupravy HC-FIA byly provedeny paralelní testy 20krát pro každý klinický vzorek výtěru z krku po dobu pěti po sobě následujících dnů. Jako reprezentativní klinické vzorky byly vybrány pozitivní vzorek (1 348 kopií na ml oblasti ORF1ab), vzorek od kriticky nemocného jedince (kritický; 512 kopií na ml) a negativní vzorek (0 kopií na ml). Průměrné hodnoty T/C tří šarží při detekci pozitivního vzorku byly následující: 199,92 ± 8,25 (CV = 4,13 %), 200,68 ± 7,91 (CV = 3,94 %) a 199,03 ± 7,43 (CV = 3,73 %) ve srovnání se 109,17 ± 5,68 (CV = 4,65 %), 110,80 ± 5.63 (CV = 5,08 %) a 111,48 ± 4,67 (CV = 4,19 %) pro kritický vzorek a s 44,66 ± 3,36 (CV = 7,52 %), 43,99 ± 2,72 (CV = 6,18 %) a 44,72 ± 2,98 (CV = 6 %) pro kritický vzorek.66 %) u negativního vzorku. Hodnoty CV mezi jednotlivými šaržemi byly 3,89 %, 4,66 % a 6,74 %. Test tedy vykazoval dobrou přesnost a reprodukovatelnost pro detekci SARS-CoV-2.

Robustnost testu HC-FIA

Pro zjištění robustnosti testu HC-FIA jsme hodnotili účinky endogenních interferenčních látek (jako je hemoglobin a mucin) a exogenních interferenčních látek (zejména klinických léčiv běžně používaných při léčbě pacientů s respiračními infekcemi, včetně antivirotik, antibiotik a hormonů). Pro tento experiment jsme použili 18 klinických vzorků výtěrů z krku, včetně šesti kritických vzorků (500-530 kopií na ml pro oblast ORF1ab podle digitální PCR), šesti negativních vzorků a šesti pozitivních vzorků. Výsledky byly rovněž zaznamenány jako poměr hodnot T/C (interferenční vzorky versus kontrolní vzorky). V připravených interferenčních vzorcích byly koncentrace hemoglobinu 0,5 g l-1, 1,0 g l-1 a 2,0 g l-1 a koncentrace pro mucin byly 5 g l-1, 10 g l-1 a 20 g l-1. Koncentrace léčiv u exogenních interferenčních vzorků (doplňkové tabulky 17-19) byly mnohem vyšší než jejich maximální plazmatické koncentrace in vivo. Podle očekávání byly všechny poměry T/C v rozmezí 0,9-1,1 (doplňková datová sada 2), což naznačuje, že test HC-FIA je odolný vůči interferencím.

Klinické hodnocení testovací soupravy HC-FIA

Pro další hodnocení účinnosti testu HC-FIA byla provedena randomizovaná dvojitě zaslepená klinická studie srovnávající test s RT-qPCR (souprava pro detekci SARS-CoV-2 vyrobená společností Shanghai ZJ Bio-Tech a schválená NMPA) nebo s výsledky klinické diagnostiky ve třech nezávislých zdravotnických zařízeních. Testovací souprava HC-FIA použitá při klinickém hodnocení obsahovala testovací karty, lyzační pufr, roztok pro konzervaci vzorků, pozitivní a negativní kontroly a reakční zkumavku se sondami DNA a značenými protilátkami. Výsledky klinické diagnózy potvrzených nebo vyloučených případů COVID-19, které poskytly určené nemocnice, byly založeny na snímcích z počítačové tomografie a na klinických projevech pacientů, jak je uvedeno v čínských pokynech „Diagnosis and Treatment Protocol for Novel Coronavirus Pneumonia (Trial Version 6.0)“. Souběžně bylo testováno celkem 734 vzorků (593 výtěrů z krku a 141 sputa) poskytnutých 670 osobami. Nezpracované údaje z klinických zkoušek jsou uvedeny v doplňkovém souboru dat 3. Souprava pro detekci RT-qPCR, kterou jsme použili, byla navržena jako systém se třemi cíli (ORF, N a E) a k rozlišení pozitivních a negativních vzorků jsme použili princip test-retest. Kromě čtyř neúspěšných testů způsobených neplatným vnitřním standardem bylo provedeno osm opakovaných testů: jeden proto, že byl pozitivní pouze jeden cílový gen rdrp, a sedm proto, že byly pozitivní pouze geny N a E. Na základě těchto testů bylo provedeno osm opakovaných testů. V těchto případech byly předchozí negativní výsledky vyloučeny.

Z 670 pacientů zařazených do studie bylo 313 mužů (46,72 %) a 357 žen (53,28 %). Jak ukazuje doplňkový obr. 3, věkové rozložení zařazené populace je podobné věkovému rozložení infekce SARS-CoV-221. Míra návštěvnosti a míra diagnózy byly rovněž vyrovnané. Výsledky z testovacích souprav HC-FIA jsou uvedeny na obr. 3, který ukazuje fotografie typických výsledků pod fluorescenčním zdrojem světla a odpovídající gradientní barevnou matici po normalizaci odečtu. Gradientová barevná matice na doplňkovém obr. 4 zobrazuje normalizované fluorescenční odečty 734 klinických vzorků (doplňkový soubor dat 3).

Fotografie typických výsledků pod fluorescenčním zdrojem světla a odpovídající odečty fluorescence jako barevně gradientní matice, normalizované na maximální hodnotu odečtu. Skupina E se skládá pouze z výsledků negativních na COVID-19. Vodorovná čára na barevném pruhu označuje mezní hodnotu. Barevná gradientová matice pro fluorescenční odečty 734 klinických vzorků je uvedena na doplňkovém obr. 4 a odpovídající číselné údaje v doplňkovém souboru dat 3.

U 621 případů byly výsledky HC-FIA a klinické diagnózy v souladu (210 potvrzených případů a 411 vyloučených případů; tabulka 1); 49 případů (27 potvrzených a 22 vyloučených podle klinické diagnózy) bylo v rozporu s výsledky HC-FIA. U 730 vzorků byly výsledky testu HC-FIA v souladu s RT-qPCR (249 pozitivních a 481 negativních; tabulka 1). Čtyři vzorky, které byly negativní na základě RT-qPCR, byly pozitivní pomocí HC-FIA. Tři z těchto vzorků pocházely od pacientů, kteří byli klinicky diagnostikováni jako vyloučení z COVID-19, což naznačuje, že test HC-FIA poskytl falešně pozitivní výsledky. Zbývající vzorek odpovídal potvrzenému případu podle klinické diagnózy, což je v souladu s testem HC-FIA.

Cohenova kappa (κ), která je často používanou metrikou spolehlivosti shody mezi kategoriálními proměnnými, je robustnějším měřítkem ve srovnání s prostou procentuální shodou mezi proměnnými, protože κ bere v úvahu shody, které se vyskytují náhodně, zejména v nevyvážených souborech dat. Hodnotu κ vyšší než 0,75 jsme považovali za ukazatel vysoké úrovně shody (dokonalá shoda odpovídá κ = 1). Jak ukazuje tabulka 2, výsledky testu HC-FIA byly ve vysoké shodě s klinickou diagnózou (κ = 0,8393) a s RT-qPCR (κ > 0,98, bez ohledu na typ vzorku).

.