Radiometrické testy vazby ligandů | Databáze znalostí aplikací | Laboratorní produkty a služby | PerkinElmer

nahoru

Přehled

Radioaktivní ligandy se běžně používají k měření vazby ligandů na receptory. V tomto testu budete měřit vazbu radioaktivně značeného ligandu na buňky nebo buněčné membrány obsahující zájmový receptor. Pro tento test lze použít jak celé buňky, tak buněčné membrány. Radioligandy lze použít k provedení saturačních křivek, kompetičních a kinetických experimentů.

Vazba ligandu na receptor

Při výběru radioligandu je třeba mít na paměti několik faktorů:

• Vysoká specifická aktivita: Radioligandy s vysokou specifickou aktivitou jsou vhodné pro testy vazby ligandů. Specifická aktivita udává, kolik radioaktivity připadá na jednu molekulu ligandu, a obvykle se udává v jednotkách Curie na milimol ligandu. Některé z našich ligandů značených 125I jsou nabízeny s maximální specifickou aktivitou (2200 Ci/mmol, pokud je k dispozici jedno značení 125I, 4400 Ci/mmol, pokud jsou k dispozici dvě značení 125I atd.). To znamená, že prakticky každá molekula ligandu dodávaného v zásobní lahvičce je radioaktivně značená. Pro tritiované ligandy (3H ligandy) byste měli v ideálním případě vybrat ligand, který má specifickou aktivitu vyšší než 20 Ci/mmol. Maximální teoretická specifická aktivita na tritium je 29 Ci/mmol (Curie na milimol tritia). Specifická aktivita nad touto hodnotou znamená, že každá molekula ligandu má v průměru alespoň jedno tritium.
• Nízká nespecifická vazba: Hydrofobní ligandy obecně vykazují vyšší nespecifickou vazbu. To lze někdy kompenzovat potažením filtrů BSA, aby se snížila nespecifická vazba. Zahrnutí BSA, solí nebo detergentů do promývacího nebo vazebného pufru může rovněž pomoci snížit nespecifickou vazbu. Pokud je základní radiochemikálie zabalena v silanizované lahvičce (viz technický list), může to znamenat, že ligand je poněkud hydrofobní
• Vysoká čistota: V ideálním případě by měla být radiochemická čistota ligandu vyšší než 90 %. Radiochemická čistota se časem snižuje a skutečná rychlost této degradace se časem zrychluje. Radiochemickou čistotu a rychlost degradace našich různých radiochemikálií naleznete v technických listech jednotlivých šarží.
• Vysoká selektivita: Čím selektivnější je ligand pro váš receptor, tím lepší budou vaše údaje. Vysoká selektivita znamená, že ligand bude většinou rozpoznáván pouze jedním zájmovým receptorem, a ne jinými receptory, které mohou být přítomny v buněčné membráně. Také použití membrán, které nadměrně exprimují zájmový receptor, může pomoci snížit případný příspěvek receptorů endogenně exprimovaných v membráně.
• Stabilita: Pokud budete muset radioligand používat delší dobu, může být pro vás stabilita důležitým faktorem. Ligandy značené 125I by měly být obecně použity do jednoho až dvou měsíců od data výroby. Tritiované ligandy by měly být obvykle použity do 3-6 měsíců od data výroby; existují však výjimky. Míru degradace a data výroby naleznete v našich technických listech specifických pro jednotlivé šarže. Můžete se také obrátit na technickou podporu a prodiskutovat doporučenou dobu použití jednotlivých radiochemikálií PerkinElmer – naše kontaktní údaje najdete v pravém horním rohu této stránky.
• Energie: 3H uvolňuje energii beta, kterou lze po přidání scintilátoru (ve formě scintilačního koktejlu, pevného scintilátoru Meltilex®, kuličky SPA atd.) měřit na scintilačním čítači. Energie beta interaguje se scintilátorem za vzniku fotonů, které jsou měřeny detektorem. 125I uvolňuje jak energii beta, tak energii gama. Pokud máte přístup pouze k čítači gama, měli byste použít radioligand značený 125I. Dalším faktorem je formát testu. 125I uvolňuje více energie podobné beta než 3H. Pro testy SPA lze účinně použít buď ligandy značené 3H, nebo 125I.

Radioaktivní vazebné testy ligandů lze provádět v několika různých formátech. Obvykle tento test provádíme ve filtračním formátu, ale test lze provést také ve formátu SPA. Formát SPA je homogenní formát, což znamená, že nejsou nutné žádné promývací kroky. Při filtrační zkoušce se nenavázaný ligand promyje pomocí vakuového rozdělovače nebo buněčného kombajnu.

Top

Formáty testů

Filtrační testy vazby ligandů

Podívejte se na další informace o tom, jaké materiály potřebujete, jaké optimalizace možná budete muset provést, a na reference pro testy vazby radioaktivních ligandů na filtračních deskách. Ve filtračním formátu se vazebný test provádí nejprve na jedné testovací destičce a poté se filtruje přes filtrační podložku nebo destičku UniFilter® pomocí buněčného kombajnu (vakuového rozdělovače). Filtry se promyjí, aby se odstranil nenavázaný radioligand. Destička filtermat nebo UniFilter se poté vysuší a před odečtením ve vhodném detektoru se přidá scintilační koktejl (nebo Meltilex®).

SPA ligand binding assays

Podívejte se na další informace o tom, jaké materiály potřebujete, jaké optimalizace můžete potřebovat provést, a na reference pro SPA radioligand binding assays. Ve formátu SPA jsou buněčné membrány zachyceny na kuličkách SPA. Když se radioligand naváže na receptor/membránu, radiochemikálie se dostane do blízkosti kuliček SPA. Energie beta z radioligandu může interagovat se scintilátorem v kuličce a vytváří signál, který lze měřit. Radioligand, který není vázán na buněčnou membránu, nebude dostatečně blízko kuličce SPA, aby mohl silně interagovat se scintilátorem.

Přehled vazby ligandu

Definice

• Afinita (účinnost): těsnost, s jakou se ligand váže na receptor. Obvykle se vyjadřuje jako rovnovážná konstanta Kd. Čím nižší je hodnota Kd, tím vyšší je afinita.
• Specificita: popisuje, jak selektivní je ligand pro jeden receptor oproti jiným podobným receptorům
• Kd: Koncentrace, při níž je 50 % receptorů obsazeno radioligandem

Farmakologické klasifikace pro ligandy

Ligandy

• Úplný agonista: ligand, který se váže na receptor a aktivuje jej a vyvolává maximální odezvu
• Částečný agonista: ligand, který se váže na receptor a vyvolává submaximální odezvu
• Antagonista: ligand, který se váže na receptor a neaktivuje jej. Antagonisté nevyvolávají žádnou odezvu, pokud jsou aplikováni samostatně. Zablokují účinky konkurenčního agonistického ligandu.
• Inverzní agonista: ligand, který se váže na receptor a snižuje odpověď pod bazální úroveň

Zkoušky

I. Saturační experiment: Měří vazebnou rovnováhu provedením titrace radioligandu, přičemž množství receptoru zůstává konstantní.

K určení Bmax (úrovně exprese receptoru) a Kd (vazebné afinity ligandu) lze použít saturační křivky.

Saturační experiment

• Celková vazba: Zvyšující se koncentrace radioligandu v nepřítomnosti studeného ligandu. Měří jak specifickou vazbu na receptor, tak i nespecifickou vazbu.
• Nespecifická vazba: Zvyšující se koncentrace radioligandu v přítomnosti studeného ligandu. Měří vazbu radioligandu na nereceptorové složky.
• Specifická vazba: Celková mínus nespecifická vazba. Měří specifickou vazbu na receptor.

II. Soutěžní experiment: Měří rovnovážnou vazbu jedné koncentrace radioligandu v přítomnosti různých koncentrací neznačeného konkurenta.

K určení afinity velkého počtu neznačených sloučenin k receptoru při screeningu lze použít konkurenční křivky. IC50 a Ki lze odvodit z údajů o konkurenci.

Konkurenční křivka

• IC50: Koncentrace konkurenčního ligandu, která vytěsní polovinu radioaktivního ligandu
• Ki: afinita studeného ligandu k receptoru

Poznámka: Při změně koncentrace radioligandu lze pozorovat posun IC50 referenční sloučeniny; Ki však zůstává stejné.

III. Kinetické experimenty: Změřte úroveň vazby v různých časech, abyste určili rychlostní konstanty pro asociaci a disociaci radioligandu.

Kinetika

• Nasycená koncentrace ligandu přidaného množství vázaného v průběhu času pro stanovení Kon
• Vysoká koncentrace přidaného neznačeného kompetitoru. a změření poklesu vázaného množství v průběhu času pro stanovení Koff

Top

Tipy a nejčastější dotazy

Ideálně, budete chtít vybrat radioligand, který má následující vlastnosti:

• Vysoká specifická aktivita (> 20 Ci/mmol pro tritiovaný ligand)
• Nízká nespecifická vazba (hydrofobní ligandy budou obecně vykazovat vyšší nespecifickou vazbu)
• Vysoká čistota (obvykle > 90% čistota)
• Vysoká selektivita
• Stabilita (pokud budete muset radioligand používat delší dobu, může být stabilita důležitým faktorem. Ligandy značené 125I by měly být obecně použity do jednoho až dvou měsíců od data výroby. Tritiované ligandy by měly být obvykle použity do 3-6 měsíců od data výroby (existují však výjimky).

Při vykreslování dat doporučujeme používat spíše experimentálně stanovenou koncentraci pracovních roztoků radioligandů než vypočtenou koncentraci. Některé radioligandy se budou lepit na stěny vašich ředicích zkumavek. Je důležité určit skutečnou koncentraci odpipetovaného radioligandu. Chcete-li experimentálně určit koncentraci roztoku radioligandu, odpipetujte několik mikrolitrů z ředicí zkumavky a položte je na filtrační podložku. Možná budete chtít také zředit tento vzorek v poměru 1:10, abyste mohli zkontrolovat své výsledky. Stanovte dpms (rozpad za minutu). Převeďte dpms na Curie pomocí následující rovnice:

1 Ci = 2,22 x 1012 dpm

Pak použijte specifickou aktivitu vaší dávky radioligandu k převodu z Curie na moly. Chcete-li určit koncentraci radioaktivity v tomto bodě, vydělte počet molů objemem, který jste nanesli na podložku filtru.

FAQs

Q. Jakou koncentraci radioligandu mám použít pro saturační křivku?
A. Obecně doporučujeme zvolit 3-5 koncentrací pod Kd a 3-5 koncentrací nad Kd. Nejvyšší koncentrace by měla být desetinásobkem Kd.

Q.Jakou koncentraci radioligandu zvolit pro kompetitivní vazbu?
A. Radioligand se používá v nízké koncentraci, obvykle na hodnotě Kd nebo pod ní. Pokud je specifická aktivita nízká, lze použít koncentraci nad hodnotou Kd, ale nikdy nesmí být na úrovni nasycující koncentrace nebo vyšší.

Q. Jaký typ ligandu bych měl použít pro stanovení nespecifické vazby v mých saturačních křivkách?
A. Obvykle chcete zvolit ligand, který je jiný než váš radioligand. Chcete vytěsnit pouze specifickou vazbu radioligandu na receptor. Měli byste zvolit ligand, který má vysokou afinitu k vazebnému místu receptoru a nízkou afinitu k nespecifickým vazebným místům.

Top

Jiné technologie společnosti PerkinElmer pro vazbu receptoru a ligandu

• DELFIA fluorescenční testy vazby receptoru a ligandu

Top

Vlastní radiochemikálie, buněčné linie, Membrány, zmrazené buňky a receptory

PerkinElmer nabízí zakázkové radiochemikálie, zakázkové buněčné linie a membrány, zakázkové mikrotitrační destičky, SPA kuličky a FlashPlates, jakož i zakázkový vývoj testů. Pokud máte zájem o zakázkové služby, obraťte se na naše zakázkové týmy:

Na>POINT® Služby vývoje zakázkových testů

Top

.