Výsledky a diskuse
Konstitutivní aktivace transkripčního faktoru NF-κB je považována za nezbytnou pro transformaci B-buněk fúzním proteinem API2-MALT1 lymfomů MALT s translokací t(11;18) . Přechodná nadměrná exprese API2-MALT1 v buňkách 293T vede k silné aktivaci reportérového genu NF-κB luciferázy , čímž poskytuje užitečný modelový systém pro studium mechanismů, kterými API2-MALT1 signalizuje NF-κB. Pro sledování účinnosti transfekce jsme v řadě experimentů koexprimovali pEGFP-N2 (Clontech). K našemu překvapení jsme zjistili, že EGFP inhibuje aktivaci NF-κB vyvolanou API2-MALT1 v závislosti na dávce (obr. 1A). Naproti tomu EGFP neovlivňoval aktivaci reportéru vyvolanou expresí podjednotek NF-κB p50/p65 (obr. 1B), což naznačuje zásah do signalizační kaskády NF-κB aktivované API2-MALT1 před NF-κB.
- Prezentace PowerPoint
- větší obrázek
- původní obrázek
(A) Aktivace NF-κB luciferázového reportéru fúzním proteinem API2-MALT1 značeným vlajkou je inhibována EGFP v závislosti na dávce.
(B) EGFP neblokuje na NF-κB závislou luciferázovou aktivitu vyvolanou expresí podjednotek NF-κB p50/p65 (C) Aktivace luciferázového reportéru NF-κB pomocí Flag-API2-MALT1 je inhibována EGFP mutovaným pro vazebný motiv TRAF6 (D) EGFP, ale ne pmaxGFP, zabraňuje aktivaci reportéru NF-κB luciferázy indukované TNF-α a fosforylaci IκB-α a JUN v buňkách 293T.
EGFP nezvyšuje hladiny HSP70 ani neindukuje HSP70B′ v buňkách 293T.
Intenzita fluorescence (Ex485/Em520nm) pro EGFP i pmaxGFP byla ∼100krát vyšší než pozadí. (E) N- a/nebo C-koncové fúzní proteiny EGFP (pro API2, CHIC2, NXF5a, NXF1, MALT1, aktin, Rab5, Syndecan binding protein 2 (SDCBP2) nebo β-Tubulin) a EGFP s jaderným lokalizačním signálem (NLS) nebo farnysilačním místem (pEGFP-F) snižují aktivitu reportéru NF-κB indukovanou TNF-α v buňkách 293T. Dole: U lidí je HSP70 konstitutivně exprimován za normálních podmínek, ale Hsp70B′ je indukován pouze v reakci na stres
Neexistuje žádná bazální exprese Hsp70B′.
Jako pozitivní kontrola exprese HSP70B′ byly buňky 293T (pruh 2) tepelně šokovány při 44 °C po dobu dvou hodin (pruh 3) a před sklizní se nechaly zotavit při 37 °C po dobu 5 (pruh 4) nebo 18 (pruh 5) hodin. Aktivita luciferázy závislá na NF-κB je pro každý experiment znázorněna jako násobná indukce vektorem transfekovaných buněk a je znázorněna graficky jako průměr a směrodatná odchylka nejméně tří nezávislých experimentů.
Všechny standardy molekulové hmotnosti jsou v kDa.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g001
MALT1 je základní signální složkou antigen-receptorové dráhy vůči NF-κB , . Předpokládá se, že BCL10 zprostředkovává oligomerizaci MALT1, která umožňuje vytvoření komplexu s TRAF6. Oligomerizace TRAF6 vyvolává aktivitu E3 ubikvitin ligázy její domény RING, což vede k modifikaci IKKγ (NEMO) prostřednictvím polyubikvitinových řetězců navázaných na Lys63. To pak usnadňuje interakci IKKγ s TGFβ aktivační kinázou 1 (TAK1), která plně aktivuje IκB kinázový komplex (IKK) prostřednictvím fosforylace IKKβ , což vede k aktivaci NF-κB. Podobně fúzní protein API2-MALT1 aktivuje NF-κB prostřednictvím polyubikvitinace IKKγ zprostředkované TRAF6 , . Interakce TRAF6 s karboxy-koncem MALT1 probíhá prostřednictvím dvou potenciálních vazebných motivů TRAF6 (PxExxAr/Ac s Ar/Ac pro aromatický nebo kyselý zbytek . Kontrola sekvence EGFP odhalila přítomnost vazebného konsensu TRAF6 (PNEKRD, AA 212-217). Krystalová struktura EGFP ukazuje, že motiv PNEKRD je vystaven ve smyčce mezi dvěma beta-listy , což naznačuje jeho přístupnost a úlohu EGFP jako negativního regulátoru prostřednictvím sekvestrace TRAF6. Experimenty co-IP však neprokázaly interakci mezi EGFP a TRAF6 (údaje nejsou uvedeny) a mutanty pro vazebný konsensus TRAF6 blokovaly aktivaci NF-κB pomocí API2-MALT1 stejně účinně jako EGFP (obr. 1C).
Pro zjištění, zda je tento účinek omezen na API2-MALT1, jsme analyzovali aktivaci NF-κB vyvolanou TNF-α v buňkách 293T exprimujících EGFP. EGFP opět snížil signalizaci NF-κB, což se projevilo nižší aktivitou reportéru a sníženou fosforylací inhibitoru NF-κB, IκB-α (obr. 1D). Dále jsme hodnotili, zda stejný účinek mohou mít i fúzní proteiny EGFP. Jak N-, tak C-koncové fúze EGFP blokovaly aktivaci NF-κB vyvolanou API2-MALT1 (údaje nejsou uvedeny) a TNFα (obr. 1E). Kromě aktivace dráhy NF-κB spouští léčba TNF-α také signalizaci JNK. Fosforylace JUN, svědčící o aktivované signalizaci JNK, je po léčbě TNF-α snížena i u EGFP (obr. 1D).
Uvádí se, že dlouhodobá vizualizace buněk exprimujících GFP indukuje produkci reaktivních forem kyslíku, což může vést k fyziologickým změnám a nakonec k buněčné smrti . Je zajímavé, že oba mutanti EGFP pro vazebný konsensus TRAF6 ztratili zelenou fluorescenci, ale účinně inhibovali signalizaci NF-κB (obr. 1C). Kromě toho pmaxGFP (Amaxa Biosystems), strukturně odlišný fluorescenční protein, neovlivňoval aktivaci NF-κB a JNK po působení TNF-α (obr. 1D), což naznačuje, že inhibice nebyla důsledkem fototoxicity spojené s volnými radikály. Jiná studie naznačila, že vysoké hladiny EGFP mohou indukovat protein tepelného šoku 70 (HSP70) , který je schopen inhibovat aktivaci NF-κB prostřednictvím interakce s IKKγ a TRAF6 . Indukce HSP70 však byla omezena na endoteliální buňky a u buněk 293T exprimujících EGFP jsme nepozorovali zvýšené hladiny HSP70 ani indukci HSP70B′ (obr. 1D-E).
Aktivace NF-κB expresí API2-MALT1 nebo po působení TNF-α je spojena s modifikací IKKγ polyubikvitinem vázaným na Lys63 pomocí TRAF6, respektive TRAF2 , . Kromě toho signalizace JNK vyvolaná TNFα vyžaduje auto-ubikvitinaci TRAF2 . Abychom posoudili možný vliv EGFP na aktivitu RING E3 ubikvitin ligázy TRAF6 nebo TRAF2, sledovali jsme ubikvitinaci prostřednictvím ubikvitinového mutanta značeného HA, který má k dispozici pouze Lys63 pro polymeraci (HA-Ub-K63). Exprese API2-MALT1 nebo stimulace TNF-α zvýšila hladinu polyubikvitinovaných proteinů v buňkách 293T a byla spojena se zvýšenou polyubikvitinací IKKγ v imunoprecipitátech a oba procesy byly blokovány EGFP (obr. 2A, dráhy 1,2,5,6). EGFP navíc snižoval bazální úroveň polyubikvitinace vázané na K63 v buňkách 293T (obr. 2A, dráhy 3 a 4). Podobně exprese API2-MALT1 nebo léčba TNFα stimuluje sestavování ubikvitinového řetězce vázaného na K48, které je opět blokováno EGFP a jeho strukturním homologem dsRed (Clontech), ale ne pmaxGFP (obr. 2B).
- Prezentace PowerPoint
- větší obrázek
- původní obrázek
(A) Buňky 293T transfekované uvedenými konstrukty a ošetřené po dobu 4 hodin 20 ng/ml TNF-α (pruh 5 a 6) byly imunoblotovány protilátkami anti-Flag (API2-MALT1), anti-HA (HA-Ub-K63) a anti-EGFP (levý panel) nebo imunoprecipitáty anti-IKKγ byly imunoblotovány protilátkou anti-Flag (IKKγ) nebo anti-HA (ubikvitin) (pravý panel).
(B) EGFP ovlivňuje polyubikvitinaci vázanou na K48.
293T buňky byly transfekovány konstruktem ubikvitinu s pouze Lys48 dostupným pro polymeraci (HA-Ub-K48), ošetřeny po dobu 4 hodin 20 ng/ml TNF-α nebo ponechány bez ošetření a buněčné lyzáty byly imunoblotovány protilátkami anti-HA (Ub-K48) a anti-EGFP.
Intenzity fluorescence (excitace 485 nm/emise 520 nm) pro EGFP a pmaxGFP byly srovnatelné (∼100krát vyšší než hodnoty pozadí), exprese pDs-Red byla potvrzena fluorescenční mikroskopií.
(C) EGFP stabilizuje exogenní API2-Myc v buňkách 293T prostřednictvím snížení jeho auto-ubikvitinace vázané na Lys48 a proteasomální degradace.
(D) Stabilní exprese EGFP v buněčné linii karcinomu z merkelových buněk MCC14.2 snižuje polyubikvitinaci a zvyšuje hladinu endogenní exprese p53.
Uveden je průměrný poměr a směrodatná odchylka signálů p53 k aktinu (tři nezávislé experimenty), (Ub)n : polyubikvitinované proteiny.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g002
Pro zjištění, zda EGFP ovlivňuje výhradně ubikvitinaci proteinů TRAF, jsme hodnotili API2, RING E3 ubikvitinovou ligázu, která se destabilizuje prostřednictvím autubikvitinace vázané na Lys48 . Koexprese EGFP inhibovala polyubikvitinaci vyvolanou API2 v buňkách 293T, což vedlo ke zvýšení hladiny exprese API2 (obr. 2C). Snížené hladiny ubikvitinace v ustáleném stavu byly pozorovány také u buněk MCC14.2 se stabilní expresí EGFP. V důsledku toho se v buňkách exprimujících EGFP mírně zvýšily základní hladiny endogenního p53, které jsou přísně regulovány prostřednictvím ubikvitinace vázané na Lys48 prostřednictvím MDM2 (obr. 2D).
Dále jsme zkoumali, zda EGFP ovlivňuje ubikvitinaci in vivo. Základní hladiny polyubikvitinace byly sníženy ve slezinných lymfocytech transgenních myší s EGFP , což souviselo se sníženou fosforylací IκB-α po stimulaci antigenem ve srovnání s kontrolními myšmi, což naznačuje, že EGFP snižuje aktivaci NF-κB vyvolanou B-buněčnými receptory (obr. 3A-B). Transgenní myši s API2-MALT1 mají v kostní dřeni deficit B220+/CD40+ B-buněk, protože aktivace NF-κB zprostředkovaná API2-MALT1 urychluje jejich zrání na naivní B-buňky . Když byly tyto API2-MALT1 transgenní myši zkříženy s EGFP myšmi, deficit B220+/CD40+ B-buněk v kostní dřeni EGFP/API2-MALT1 dvojitých transgenních myší (obr. 3C) se obnovil, což dále podporuje vliv na ubikvitinaci a NF-κB signalizaci in vivo. Podobně byla polyubikvitinace snížena v jaterních buňkách EGFP myší a souvisela se stabilizací p53, jak ukazuje zvýšení hladiny jeho exprese (obr. 3A, D). Hlavním cílovým genem p53 při poškození DNA vyvolaném γ-zářením v játrech je p21, který je nutný pro zastavení buněčného cyklu a opravu DNA . V souladu s tím poškození DNA vyvolané γ-zářením způsobilo nejen vyšší reakci p53 u myší s EGFP, ale také mírně zvýšilo indukci p21 (obr. 3D). Nakonec byly provedeny pokusy in vitro s cílem vyhodnotit, zda EGFP přímo ovlivňuje sestavování ubikvitinových řetězců; rekombinantní EGFP však neovlivnil polyubikvitinaci kontrolního substrátu (obr. 3E), což naznačuje na buněčném kontextu závislý účinek EGFP na ubikvitinaci.
- Prezentace PowerPoint
- větší obrázek
- původní obrázek
(A) Western bloty extraktů sleziny a jater z FVB divokého typu (wt) a transgenních myší s EGFP detekované pomocí protilátek proti ubikvitinu, EGFP a aktinu (kontrola zatížení).
(B) EGFP snižuje fosforylaci IκB-α v anti-IgM/anti-CD40 stimulovaných B-lymfocytech purifikovaných z EGFP myší.
Experimenty byly provedeny ve třech opakováních, uveden je reprezentativní snímek jednoho experimentu.
Uvedeny jsou průměrné hodnoty a směrodatné odchylky poměrů IκB-α-P k aktinu vzhledem k nestimulovaným buňkám.
(C) Deficit B220+/CD40+ B-buněk v kostní dřeni API2-MALT1 myší je obnoven u dvojitých transgenních myší s EGFP/API2-MALT1.
Experimenty provedené ve třech opakováních, je zobrazen průměr a směrodatné odchylky. eMalt1: endogenní Malt1, *a-specifický pás (D) EGFP myši vykazují zvýšené hladiny p53 v játrech a mají zvýšenou reakci p53/p21 při poškození DNA vyvolaném γ-zářením.
Uvedeny jsou průměrné hodnoty a směrodatné odchylky poměrů signálů p53/p21 k aktinu vzhledem ke vzorku 1.
(E) Rekombinantní EGFP (rEGFP) nebrání polyubikvitinaci substrátu biotin-lysozymu in vitro. (Ub)n: polyubikvitinované proteiny.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g003
Závěrem naše údaje naznačují, že EGFP a fúzní proteiny EGFP ovlivňují procesy závislé na RING E3 ubikvitinové ligáze, jako je signalizace NF-κB a JNK nebo homeostáza p53 v buněčných liniích a u myší. NF-κB hraje ústřední roli v regulaci různých biologických procesů, včetně vrozené a adaptivní imunity, vývoje, růstu a přežívání buněk. Signály podporující přežití jsou důsledkem zvýšené exprese inhibitorů apoptózy, například B-buněčné leukémie/lymfomu-XL. Zvýšení apoptózy vyvolané EGFP v buňkách nebo v motorické kůře a striatu mozku myší proto může souviset se sníženou aktivitou NF-κB v důsledku defektní polyubikvitinace a aktivace/degradace jeho předřazených regulátorů. Defektní ubikvitinace je také postulována jako příčina svalové dystrofie končetinového pásu, která je spojena s mutacemi v Trim32, ubikvitinové ligáze pro aktin . Protože bylo prokázáno, že EGFP narušuje interakce aktinu a myozinu ve svalových buňkách a vyvolává dilatační kardiomyopatii u myší s EGFP , je lákavé spekulovat, že ubikvitinace aktinu může hrát zásadní roli v normálním fungování svalů a že její deregulace pomocí EGFP způsobuje výše uvedené fenotypy. Vzhledem k nově se objevující úloze ubikvitinace v mnoha buněčných procesech je proto třeba pečlivě zvážit použití EGFP jako reportéru živých buněk
.
Napsat komentář