Oxidačně fermentační test (OF) byl vyvinut Hughem a Leifsonem v roce 1953. Vyvinuli OF médium k rozlišení oxidačních bakterií (které produkují kyselinu ze sacharidů pouze za aerobních podmínek) a fermentativních bakterií (které produkují kyselinu jak za aerobních, tak za anaerobních podmínek).
Sacharolytické mikroorganismy rozkládají glukózu buď fermentativně, nebo oxidativně. Konečnými produkty fermentace jsou poměrně silné směsné kyseliny, které lze detekovat v běžném fermentačním testovacím médiu. Kyseliny vznikající při oxidační degradaci glukózy jsou však extrémně slabé a je jich méně a k detekci je zapotřebí citlivější oxidační fermentační médium Hugh a Leifsonovo médium OF. Toto médium bylo vyrobeno zvýšením množství glukózy nad množství, které se nachází v médiu používaném k detekci fermentace, a snížením množství peptonu.
Prostředí OF Hugha a Leifsona se liší od sacharidového fermentačního média takto:
- Koncentrace agaru je snížena ze 3 % na 2 %, takže má polotuhou konzistenci (To pomáhá při stanovení pohyblivosti organismu).
- Koncentrace peptonu je snížena z 11 % na 2 %. (snižuje se množství alkalických produktů vznikajících při metabolismu peptonu; tím se snižuje neutralizační účinek těchto produktů).
- Koncentrace sacharidů se zvyšuje z 0,5 % na 1 %.0 % (Zvýšená koncentrace glukózy v médiu zvyšuje produkci těchto slabých kyselin na úroveň, kterou lze zjistit pomocí indikátoru bromthymolové modři.)
Princip:
Oxidačně-fermentační test určuje, zda určité gramnegativní tyčinky metabolizují glukózu fermentací nebo aerobní respirací (oxidativně). Během anaerobního procesu fermentace se pyruvát přeměňuje na různé smíšené kyseliny v závislosti na typu fermentace. Vysoká koncentrace kyselin vznikajících během fermentace změní v přítomnosti nebo nepřítomnosti kyslíku bromthymolový modrý indikátor v OF médiu ze zeleného na žlutý .
Některé nefermentující gramnegativní bakterie metabolizují glukózu pomocí aerobní respirace, a proto produkují během glykolýzy a Krebsova cyklu pouze malé množství slabých kyselin. Snížení množství peptonu a zvýšení množství glukózy usnadňuje detekci takto produkovaných slabých kyselin. K další podpoře detekce kyselin se přidává pufr fosforečnanu draselného.
Použití:
OF Test se používá k určení, zda gramnegativní bakterie metabolizují sacharidy oxidativně, fermentací nebo jsou nesachrolytické (nemají schopnost využívat sacharidy v médiu).
Médium:
Hughovo a Leifsonovo OF bazální médium; složky jsou následující:
- Chlorid sodný : 5,0 g
- Fosforečnan draselný : 0,3 g
- Pepton : 2.0 g
- Bromthymolová modř:0,03 g
- Agar: 3,0 g
- Glukóza : 10 g
- Voda : 1000 ml
Před autoklávováním by mělo být pH upraveno na 7,1. Po autoklávování média při 121 °C po dobu 15 minut se do média asepticky přidá filtrem sterilizovaný roztok 10% roztoku sacharidů na konečnou koncentraci 1 %.
Postup
- Dvě zkumavky s testovacím médiem OF se naočkují testovaným organismem pomocí přímého drátku zapíchnutím „do poloviny dna“ zkumavky.
- Pokryjte jednu zkumavku z každé dvojice 1 cm vrstvou sterilního minerálního oleje nebo tekutého parafínu (vytváří anaerobní podmínky ve zkumavce tím, že zabraňuje difúzi kyslíku) a druhou zkumavku ponechte otevřenou vzduchu.
- Inkubujte obě zkumavky při 35 °C po dobu 48 hodin (Pomalu rostoucím bakteriím může trvat 3 až 4 dny, než bude možné pozorovat výsledky)
Interpretace
Tvorba kyseliny se v médiu zjistí výskytem žluté barvy. V případě oxidativních organismů; produkce barvy může být nejprve zaznamenána u povrchu média.
Následují reakční vzorce:
- Výsledek fermentace: Produkce kyseliny na obou (otevřených i zakrytých) zkumavkách. Vzniklá kyselina mění indikátor pH, bromthymolovou modř, ze zelené na žlutou. např. Escherichia coli
- Oxidační výsledek: Produkce kyseliny v otevřené zkumavce (aerobní) a nikoli ve zkumavce pokryté olejem (anaerobní) znamená oxidační výsledek. Nefermentující bakterie, které metabolizují glukózu oxidativním metabolismem, dávají oxidativní výsledek. např. Pseudomonas aeruginosa
- Nesacharolytická (negativní výsledek OF): Nesachrolytické bakterie dávají negativní výsledek OF. Negativní výsledek je indikován žádnou změnou barvy ve zkumavce pokryté olejem a v některých případech zvýšením pH (pH 7,6), které mění bromthymolovou modř ze zelené na modrou v horní části otevřené zkumavky. Zvýšení pH je způsobeno produkcí aminů bakteriemi, které rozkládají pepton (bílkovinu) v médiu.
Např. Alcaligenes faecalis.
Kontrola kvality
- Glukózový fermentor: Escherichia coli
- Oxidátor glukózy: Pseudomonas aeruginosa
- Nesacharolytik: Moraxella species
.
Napsat komentář