Nulové alely Trp53 a mutantní alely R270H mají srovnatelný vliv na regulaci invaze, metastázování a genové exprese v myším nádoru tlustého střeva

Missense a nulové mutace Trp53 podporují progresi nádoru tlustého střeva u myší CDX2P-CreER T2 Apc fl/+ , Kras LSL-G12D (AK) myši

Pro vytvoření modelu myšího nádoru tlustého střeva podníceného genovými defekty, jaké se často vyskytují u lidských nádorů tlustého střeva, jsme vytvořili složené mutantní myši nesoucí jednu floxovanou alelu Apc (Apcflox, 580S, zkráceně A), kterou lze inaktivovat funkcí rekombinázy Cre, a floxovanou, latentně onkogenní alelu Kras (KrasLSL-G12D, zkráceně K), kterou lze aktivovat rekombinací Cre. Pomocí transgenu CDX2P-CreERT2 a ošetření TAM k aktivaci funkce Cre v epiteliálních buňkách tlustého střeva jsme se zaměřili na alely Apc a Kras v epitelu distálního ilea, céka a tlustého střeva. Zatímco myši CDX2P-CreERT2 K vykazovaly vroubkovaný a hyperplasický epitel tlustého střeva , myši CDX2P-CreERT2AK (AK) měly vroubkovaný a hyperplastický epitel tlustého střeva a také se u nich vyvinulo v průměru 13 adenomů o velikosti od 0,5 mm do 2 mm v době, kdy bylo u myší dosaženo humánního konce 10-15 měsíců po léčbě TAM (obr. 1a). U šesti z deseti myší AK jsme nalezli jeden nebo dva adenokarcinomy vznikající v céku. Z celkového počtu osmi adenokarcinomů nalezených u deseti studovaných AK myší sedm nádorů invadovalo do muscularis propria (MP) nebo hlouběji a pět dosáhlo subserózy nebo serózy (obr. 1b, tab. 1 a doplňková tab. 1). Protože však pouze 8 ze 131 pozorovaných nádorů u myší AK bylo invazivních, z těchto zjištění vyplývá, že pro vznik invazivních nádorů tlustého střeva u myší AK byly kromě mutací Apc a Kras nutné další somatické defekty.

Missense a null mutace Trp53 podporují progresi nádorů tlustého střeva u myší CDX2P-CreERT2 Apcfl/+, KrasLSL-G12D (AK). a Kaplan-Meierovy křivky přežití myší CDX2P-CreERT2AK (AK) (n = 10, medián přežití = 336 dní), myší CDX2P-CreERT2AKP270/+ (AKP270/+) (n = 16, medián přežití = 166 dní), CDX2P-CreERT2AKPfl/fl (AKPfl/fl) myši (n = 16, medián přežití = 97 dní) a CDX2P-CreERT2AKP270/fl (AKP270/fl) myši (n = 20, medián přežití = 88 dní). TAM byl podáván denně po dobu dvou dnů a čas nula představuje druhý z těchto dnů. P-hodnoty byly získány pomocí log-rank testu při následujících srovnáních: P = 1,4E-6 pro AK vs. AKP270/+; P = 1,4E-7 pro AKPfl/fl vs. AKP270/+; P = 1,9E-8 pro AKP270/fl vs. AKP270/+. b Procento nádorů tlustého střeva s různou hloubkou invaze u AK myší, AKP270/+ myší, AKPfl/fl myší a AKP270/fl myší. Údaje jsou z více lézí na jednu myš (n = 10-14 myší na skupinu). P-hodnoty založené na Fisherových exaktních testech a exaktních Poissonových testech jsou uvedeny v tabulce 1, resp. v doplňkové tabulce 1. Chybové úsečky jsou standardní chyby průměru. A adenom, SM submukóza, MP muscularis propria, SS subseróza, S seróza. c, d Hematoxylin a eosin (H&E) barvení reprezentativních invazivních nádorů z tkání proximálního tračníku (vpravo) a céka (vlevo) jsou zobrazeny pro myši AKP270/fl (c) a AKPfl/fl (d). Nádory v (c) a (d) byly odebrány 3 měsíce po injekci TAM. Obrázky s velkým zvětšením jsou zobrazeny ve spodních panelech a v odpovídajících horních panelech jsou v rámečcích vyznačeny oblasti s menším zvětšením. Přerušované čáry označují hranici mezi svalovou vrstvou a subserózou. Měřítka: 500 μm pro snímek s malým zvětšením (horní panely); 100 μm pro obrázky s velkým zvětšením (spodní panely)

Jak bylo uvedeno výše, mutace TP53 se vyskytují přibližně u 60 % lidských CRC a zdá se, že jsou selektovány během progrese adenomu-karcinomu . Snažili jsme se posoudit spolupráci inaktivace Trp53 s mutacemi Apc a Kras při progresi nádoru tlustého střeva in vivo a také zjistit, zda lze na modelu pozorovat potenciální GOF účinky missense mutované alely Trp53. Do modelu AK jsme zavedli konstitutivní mutantní alelu Trp53R270H (myší ekvivalent lidské R273H, označovaný jako P270) a/nebo podmíněnou nulovou alelu Trp53flox (označovaný jako Pfl). Byly vytvořeny myši se složenými genotypy a jejich zkratky jsou následující: CDX2P-CreERT2AKP270/+ (myši AKP270/+), CDX2P-CreERT2AKP270/fl (myši AKP270/fl) a CDX2P-CreERT2AKPfl/fl(myši AKPfl/fl). U kohort dospělých myší AKP270/+, AKP270/fl a AKPfl/fl byly léčbou TAM vyvolány nádory tlustého střeva a byl sledován jejich zdravotní stav. Ve srovnání s myší AK (medián přežití = 336 dní) měly myši AKP270/+, AKP270/fl a AKPfl/fl výrazně zkrácenou délku života. Myši AKP270/fl a AKPfl/fl měly medián přežití 88, resp. 97 dní a myši AKP270/+ měly medián přežití 166 dní (obr. 1a). Myši AKP270/+ měly významně delší přežití než myši AKP270/fl a AKPfl/fl (P < 0,0001 pro každou z nich ve srovnání s myší AKP270/+), ale při porovnání myší AKP270/fl a AKPfl/fl nebyl pozorován žádný statisticky významný rozdíl v přežití (obr. 1a). Přidání mutace (mutací) Trp53 (R270H nebo nulové) významně zvýšilo celkový výskyt nádorů ve srovnání s výskytem pozorovaným u myší AK (P < 0,0001 pro AKPfl/fl i AKP270/fl při srovnání s myšmi AK, doplňková tabulka 1 vlevo dole). Myši AKP měly také více nádorů tlustého střeva a slepého střeva, které vykazovaly invazivní rysy (7,3 a 8,9 invazivních nádorů na myš u myší AKPfl/fl a AKP270/fl) ve srovnání s myšmi AK (0,8 invazivních nádorů na myš; obr. 1b a doplňková tabulka 1 vpravo nahoře, P < 0,0001 pro obě myši AKPfl/fl vs. AKP270/fl). AK i AKP270/fl vs. AK srovnání).

Hloubková analýza tkání céka a tlustého střeva myší získaných při nekropsii definovala rozsáhlou nádorovou zátěž u myší AKP270/+, AKPfl/fl a AKP270/fl, s lézemi od adenomů po adenokarcinomy v pozdním stadiu (obr. 1b-d a tab. 1). Všechny studované myši AKP270/+, AKPfl/fl a AKP270/fl měly alespoň jeden adenokarcinom (nádory se submukózou nebo hlubší invazí). Důkazy o invazi do hladké svaloviny a v některých případech do serózy byly nalezeny jak v céku, tak v proximálních oblastech tlustého střeva u myší AKP270/fl a AKPfl/fl (obr. 1c, resp. d). Myši AKP270/+, u nichž si epiteliální buňky cílené pomocí Cre zpočátku zachovaly jednu funkční alelu Trp53 divokého typu, měly delší dobu latence pro vznik nádoru a celkovou nádorovou zátěž (18,5 na myš) i procento nádorů s hlubší invazí (11.9 %) byly ve srovnání s myšmi AKP270/fl nebo AKPfl/fl významně nižší (doplňková tabulka 1 a tabulka 1, P < 0,01 ve srovnání s myšmi AKP270/fl nebo AKPfl/fl pro nádorovou zátěž na myš a procento adenokarcinomů). Tato zjištění podporují názor, že divoký typ p53 má nádorově supresorovou funkci v tumorigenezi tlustého střeva i v kontextu missense mutantní alely Trp53. Při porovnání všech pozorovaných nádorů u myší AKP270/fl a AKPfl/fl jsme zjistili, že podíl adenokarcinomů se submukózní nebo hlubší invazí byl vyšší u myší AKP270/fl než u myší AKPfl/fl (36,9 % u myší AKP270/fl a 26,1 % u myší AKPfl/fl; tabulka 1, P = 0,0026), což naznačuje možný mírný GOF efekt alely Trp53 R270H při zvyšování invaze tkáně. Mírné zvýšení invazivního potenciálu u myší AKP270/fl však může být kompenzováno, protože průměrná nádorová zátěž na myš má u myší AKPfl/fl vyšší tendenci než u myší AKP270/fl (28,0 vs 24,2 na myš, P = 0.054; doplňková tabulka 1) a myši AKPfl/fl a AKP270/fl nevykazovaly významné rozdíly ve výskytu adenokarcinomů (7,3 vs 8,9 adenokarcinomu na myš, doplňková tabulka 1 vpravo nahoře, P = 0,16). Dále byla pozorována invaze některých nádorů do muscularis propria, subserózy nebo serózy u myší AKP270/fl i AKPfl/fl (obr. 1b a tab. 1). Vzhledem k tomu, že pouze asi 30 % nádorů u myší AKP270/fl nebo AKPfl/fl progredovalo během sledovaného období do adenokarcinomů, jsou pro vznik karcinomů u myší AKP pravděpodobně rozhodující další somatické změny kromě defektů Apc, Kras a Trp53.

Histologie nádorů a metastáz u myší AKP270/fl nebo AKPfl/fl

U každé z myší AKP270/fl a AKPfl/fl se do dosažení humánních koncových bodů vyvinul jeden nebo více adenokarcinomů. U myší AKP270/fl vykazovalo více než 80 % adenokarcinomů dobře až středně diferencované znaky s nádorovým pupenem/rozrůstáním na invazivní frontě a příležitostnou sekrecí mucinu (obr. 2a, nahoře). Přibližně 15-20 % adenokarcinomů AKP270/fl bylo špatně diferencovaných, se solidní morfologií trabekulárního typu (obr. 2a, uprostřed). U myší AKP270/fl byly vzácně pozorovány karcinomy z buněk signetova prstence (obr. 2a, dole). U myší AKPfl/fl bylo přibližně 50 % adenokarcinomů dobře až středně diferencovaných se sekrecí mucinu (obr. 2b, nahoře); zbytek byl špatně diferencovaný (obr. 2b, dole). V invazivních AKP270/fl a AKPfl/fl nádorech bylo pozorováno silné jaderné a cytoplazmatické barvení β-kateninu (obr. 2, uprostřed), což odpovídá defektní Wnt signalizaci vzniklé inaktivací Apc. V nádorových buňkách AKP270/fl bylo pozorováno silné jaderné barvení p53. Podle očekávání nebylo barvení na p53 pozorováno v nádorových buňkách AKPfl/fl (obr. 2, vpravo).

Histologické typy adenokarcinomů tlustého střeva od p53 mutantních myší. Obarvení H&E (levé panely) a imunohistochemické barvení na β-katenin (prostřední panely) a p53 (pravé panely) jsou zobrazeny pro nezávislé nádory tlustého střeva reprezentativních histologických typů od myší AKP270/fl (a) a AKPfl/fl (b). Nádory byly odebrány 3 měsíce po indukci TAM. Měřítka: 50 μm

Při nekropsii byly nalezeny metastázy v lymfatických uzlinách u 3 ze 13 myší AKPfl/fl a u 5 ze 14 myší AKP270/fl (tabulka 2). Ze tří myší AKPfl/fl, které měly každá metastázu v břišní lymfatické uzlině, měla jedna myš také mnohočetné metastázy v plicích a další myš měla mnohočetné metastázy v játrech (tabulka 2). Z pěti myší AKP270/fl, z nichž každá měla metastázy v břišní lymfatické uzlině, měla jedna myš mnohočetné metastázy v plicích a další měla metastatické léze v plicích i játrech (tabulka 2). U myší AK nebo AKP270/+ nebyly nalezeny žádné metastatické léze (tabulka 2). Naše údaje naznačují, že myší CRC s missense nebo null mutacemi v Trp53 mohou dávat vznik spontánním lymfatickým uzlinám a vzdáleným metastázám se srovnatelnou frekvencí, což svědčí proti GOF efektu missense mutací Trp53 při zvyšování metastáz v našem myším modelu CRC.

Epitelo-mezenchymální přechod u metastatických CRC s missense nebo null Trp53

V jednotlivých lymfatických uzlinách metastatických ložisek nalezených u každé z pěti různých myší AKP270/fl, čtyři ložiska vykazovala středně diferencovaný adenokarcinom a jedno ložisko bylo špatně diferencované (obr. 3a, b, horní panely). Všechny středně diferencované metastatické léze v lymfatických uzlinách měly silné jaderné barvení na β-katenin a také silné membránové barvení na E-cadherin a chybějící barvení na vimentin (obr. 3a), což naznačuje zachování epiteliálních vlastností u metastatických buněk AKP270/fl, které si zachovaly středně diferencované rysy. U jedné myši AKP270/fl, jejíž metastázy v lymfatických uzlinách měly špatně diferencované rysy, byly adenokarcinomové léze se špatně diferencovanou morfologií nalezeny také v plicích, játrech a céku (obr. 3b a doplňkový obr. 1). Špatně diferencovaná léze v céku a metastatické léze vykazovaly silné jaderné barvení β-kateninu a ztrátu exprese E-kadherinu a silnou expresi vimentinu, což odpovídá rysům epiteliálně-mezenchymálního přechodu (EMT) (obr. 3b a doplňkový obr. 1). Všechny metastatické léze u myší AKP270/fl se pozitivně barvily na CDX2 (doplňkový obr. 2), což odpovídá jejich epiteliálnímu původu v tlustém střevě

Metastatické nádory pocházející z tlustého střeva s missense mutacemi Trp53 mohou podléhat epiteliálně-mezenchymálnímu přechodu (EMT). Fotomikrofotografie řezů obarvených H&E zobrazující metastázy v lymfatických uzlinách a plicích nalezené u dvou zástupců myší AKP270/fl (a, b, horní panely). Imunohistochemická barvení ukazující silnou jadernou expresi β-kateninu, silnou membránovou expresi E-kadherinu a absenci exprese vimentinu u středně diferencovaných lézí nalezených u jedné reprezentativní myši (a, tři spodní panely). Naproti tomu slabě diferencované léze nalezené u jiné myši (b) vykazují silnou jadernou expresi β-kateninu, ztrátu exprese E-kadherinu a silnou expresi vimentinu, což naznačuje, že metastatické léze nalezené u této myši prošly EMT (b, spodní tři panely). Reprezentativní fotomikrofotografie řezů obarvených H&E byly pro orientaci zobrazeny při malém zvětšení; sériové řezy byly podrobeny imunohistochemickému barvení a rámečkem označené oblasti s barvením na β-katenin, E-kadherin a vimentin byly zobrazeny při velkém zvětšení. Měřítka: 20 μm pro všechny snímky

Dvě ze tří metastáz lymfatických uzlin z myší s nádorem AKPfl/fl byly středně diferencované a jedna byla špatně diferencovaná (obr. 4a, b, horní panely). Myš AKPfl/fl s metastázami v játrech měla středně diferencované metastázy v lymfatických uzlinách. U této myši s jaterními metastázami vykazoval předpokládaný indexový primární adenokarcinom tlustého střeva i metastatické léze v lymfatických uzlinách a játrech silnou jadernou expresi β-kateninu a silnou membránovou expresi E-kadherinu (doplňkový obr. 3). U jediné myši AKPfl/fl se špatně diferencovanou metastázou v lymfatických uzlinách byly nalezeny četné léze s podobnou morfologií také v plicích (obr. 4b). Imunohistochemické studie ukázaly, že všechny plicní metastatické léze a předpokládaný indexový primární adenokarcinom v céku měly silnou jadernou expresi β-kateninu a sníženou expresi E-kadherinu a silnou expresi vimentinu, což odpovídá EMT u primárního nádoru a metastatických buněk (obr. 4b). Všechny metastatické léze u myší AKPfl/fl byly CDX2 pozitivní (doplňkový obr. 4). Celkově naše údaje naznačují, že neexistuje žádný významný rozdíl v histologických vlastnostech metastatických lézí vzniklých u myší AKP270/fl nebo AKPfl/fl a že špatně diferencovaná podskupina primárních nádorů a metastatických lézí s missense nebo null mutacemi Trp53 může vykazovat znaky EMT.

Metastatické nádory s nulovými mutacemi Trp53 mohou podléhat epiteliálně-mezenchymálnímu přechodu (EMT). a Fotomikrofotografie řezu barveného H&E zobrazující středně diferencovanou nádorovou lézi nalezenou v lymfatické uzlině reprezentativní myši AKPfl/fl 2,5 měsíce po injekci TAM (horní panel). Imunohistochemická barvení této léze ukazují silnou jadernou expresi β-kateninu, silnou membránovou expresi E-kadherinu a absenci exprese vimentinu (spodní tři panely). b Fotomikrofotografie řezů obarvených H&E zobrazující slabě diferencované léze nalezené v céku, lymfatické uzlině a plicích jiné myši AKPfl/fl 4 měsíce po injekci TAM (horní panel). Všechny tyto léze vykazují silnou jadernou expresi β-kateninu, ztrátu exprese E-kadherinu a silnou expresi vimentinu, což naznačuje, že primární a metastatické léze nalezené u této myši prošly EMT (spodní tři panely). Reprezentativní fotomikrofotografie řezů obarvených H&E byly pro orientaci zobrazeny při malém zvětšení; sériové řezy byly podrobeny imunohistochemickému barvení a rámečkem označené oblasti s barvením na β-katenin, E-kadherin a vimentin byly zobrazeny při velkém zvětšení. Měřítka: 20 μm pro všechny snímky

Stabilizace missense mutovaného proteinu p53 je spojena se ztrátou divokého typu p53 a progresí onemocnění

U většiny lidských nádorů s missense mutací TP53 byla zjištěna ztráta heterozygozity (LOH) TP53 , přičemž jedna studie naznačila, že LOH TP53 je předpokladem pro stabilizaci missense mutovaného proteinu p53 jak u myších sarkomů, tak u karcinomů prsu . Hodnotili jsme vzorce barvení p53 v různých fázích vývoje nádoru u myší AKP270/+ po indukci tumorigeneze injekcí TAM, protože epitel tlustého střeva cílený Cre u myší AKP270/+ má zpočátku jednu funkční alelu Trp53. V hyperplastických polypech u myší AKP270/+, kde je aktivován Kras a kde ještě nedošlo k LOH Apc, je barvení p53 nedetekovatelné (obr. 5b, panel HP), podobně jako negativní barvení p53 pozorované v epitelu myší divokého typu (obr. 5a), přestože protein p53 R270H missense mutant je konstitučně exprimován v tkáních tlustého střeva myší AKP270/+. Určitá imunoreaktivita p53 byla jasně patrná u adenomů (obr. 5b, panel adenomů a tab. 3, n = 185) a karcinomů (obr. 5c a tab. 3, n = 28) vzniklých u myší AKP270/+. Mezi těmito nádory 94 % adenomů a 43 % karcinomů vykazovalo slabé barvení p53 (obr. 5 a tab. 3, 5-10% pozitivita), zatímco 6 % adenomů a 57 % karcinomů mělo silné barvení p53 (obr. 5 a tab. 3, >10% pozitivita, P < 0,0001). Většina nádorů se silným barvením p53 vykazovala LOH p53, zatímco nádory se slabým barvením p53 si stále zachovávaly alelu Trp53 divokého typu (obr. 6). Naše výsledky jsou podobné těm, které byly pozorovány v nedávné práci o expresi missense proteinu p53 u myších sarkomů a karcinomu prsu . Naše údaje ukazují, že podobně jako v případě nádorového onemocnění tlustého střeva u člověka , exprese stabilizovaného missense mutantního proteinu p53 úzce koreluje se ztrátou funkce divokého typu p53 a progresí do invaze.

Stabilizace mutantního proteinu p53R270H během progrese nádoru od hyperplazie ke karcinomu u myší AKP270/+. Imunohistochemické barvení p53 v reprezentativním hyperplastickém polypu (HP, b, levý panel), adenomu (b, pravý panel) a třech karcinomech (c) vzniklých v céku myší AKP270/+. Jako kontrola byl použit řez z céka myši divokého typu (a). Barvení p53 se pohybuje od nedetekovatelného barvení v normálních řezech (a) a HP (b), přes slabé barvení (<10% pozitivita) v adenomu (b) a karcinomu 1(c, levý panel) až po silné barvení v karcinomech 2 a 3 (>10% pozitivita). Přerušované čáry označují muscularis mucosae. Černé šipky označují invazivní žlázy se slabým barvením p53; červené šipky označují invazivní žlázy se silným barvením p53. Měřítka: 50 μm

Stabilizace missense mutantu p53R270H koreluje se ztrátou heterozygozity p53 (LOH). a Genotypizace nádorů tlustého střeva (T2-T6) vzniklých u AKP270/+ myší 5 měsíců po indukci TAM. Jako pozitivní a negativní kontrola je použit nádor vzniklý u myši AKP270/fl (T1) a tkáň tlustého střeva z myši divokého typu (N). Přítomnost alely Trp53 divokého typu a rekombinované mutantní alely Trp53 (flox out) byla zjištěna pomocí PCR. b-e Imunohistochemické barvení p53 v tkáních tlustého střeva popsaných v (a) ukazuje silnou korelaci mezi stabilizací mutantního p53 (d, T2 a T3) a ztrátou heterozygozity p53 ve srovnání se slabým barvením p53 a přítomností alely Trp53 divokého typu v nádorech 4-6 (e). Přerušované čáry označují muscularis mucosae. Měřítka: 100 μm

Globální profilování genové exprese odhaluje jen málo rozdílů mezi myšími nebo lidskými nádorovými buňkami tlustého střeva nesoucími missense mutantní a nulové alely Trp53/TP53 R270H/R273H

Profilovali jsme genovou expresi v tkáních adenokarcinomů tlustého střeva z myší AKP270/fl (n = 6) nebo AKPfl/fl (n = 6) s použitím Affymetrix Mouse ST 2.1 s 24 562 sadami sond. RNA jsme izolovali po laserové mikrodisekci (LCM) nádorových buněk z jednoho invazivního primárního nádoru od každé myši. Jako kontroly byly zahrnuty mikrodisekce normálních epiteliálních buněk tlustého střeva z myší divokého typu (n = 3). Pro těchto 15 vzorků jsme sestavili modely ANOVA s podmínkami pro 3 střední hodnoty. Srovnání nádorových tkání s normálními tkáněmi poskytlo více než 2400 sad sond s P < 0,001 pro nádory AKP270/fl i AKPfl/fl, ale srovnání obou typů nádorů navzájem poskytlo pouze 30 sad sond, přičemž pouhou náhodou očekáváme 24,6 sad sond (24 562*0,001). Tento druhý výsledek naznačuje, že většina z 30 nalezených sad sond je falešně pozitivních (tabulka 4, horní část) a že mezi nádory tlustého střeva s missense mutacemi Trp53 a nádory s nulovými mutacemi Trp53 bylo jen málo významných pozorovatelných rozdílů v genové expresi, pokud vůbec nějaké byly. V souladu s touto představou jsme zjistili, že adenokarcinomy AKP270/fl a AKPfl/fl jsou v analýzách hlavních komponent (PC) genové exprese nerozlišitelné, ačkoli obě skupiny nádorů mají vzorce genové exprese jasně odlišné od epitelu tlustého střeva divokého typu (doplňkový obr. 5).

Provedli jsme také analýzu genové exprese Affymetrix na organoidech odvozených z nádorů tlustého střeva vzniklých u myší AKP270/fl (n = 3) nebo AKPfl/fl (n = 2). Jako kontroly byly použity organoidy odvozené z adenomů u myší Apcfl/fl (Cont 1, n = 3) nebo z epitelu tlustého střeva divokého typu (Cont 2, n = 4). Na čtyři skupiny organoidů jsme aplikovali model ANOVA. Ve srovnání s Apc-null organoidy (Cont 1, tabulka 4) jsme nalezli 435 sad sond s P < 0,001 pro AKPfl/fl organoidy a 609 sad sond pro AKP270/fl organoidy. Kromě toho bylo identifikováno více diferenciálně exprimovaných sad sond (960 pro AKPfl/fl a 1332 pro AKP270/fl, P < 0,001), když byly AKPfl/fl nebo AKP270/fl organoidy porovnány s organoidy normálního tlustého střeva (Cont2, Tabulka 4). Provedli jsme test obohacení drah u genů, které byly rozdílně exprimovány v nádorech a organoidech AKPfl/fl i AKP270/fl ve srovnání s normálním epitelem tlustého střeva. Zjistili jsme, že jak u nulových, tak u missense mutovaných nádorových buněk p53 byla významně změněna celá řada drah, přičemž nejvýznamněji změněnými soubory genů byly geny zapojené do G2M-kontrolního bodu, buněčného růstu, stresové odpovědi a buněčného metabolismu (doplňková tabulka 2). Pro srovnání AKPfl/fl vs. AKP270/fl jsme však získali pouze 35 sad sond s P < 0,001 (tabulka 4), přičemž 24,6 bylo opět očekáváno náhodou, což ukazuje, že bylo obtížné najít rozdíly v expresi genů mezi organoidy s nulovou a missense mutací Trp53. PC grafy ukázaly, že vzorky AKPfl/fl a AKP270/fl se vždy shlukovaly dohromady a byly odděleny od organoidů získaných z adenomů s mutací Apc (Cont1, doplňkový obr. 6) nebo normálního epitelu tlustého střeva (Cont2, doplňkový obr. 6).

Pro ověření, zda existují prokazatelné rozdíly ve vzorcích genové exprese mezi lidskými CRC s missense a null mutacemi TP53, jsme analyzovali log2-transformované normalizované počty z dat RNA-seq pro CRC v The Cancer Genome Atlas (TCGA) , porovnáním 9 nádorů s missense mutacemi v kodonu 273 TP53 s 36 nádory s nulovými mutacemi (způsobenými posunem rámce, sestřihovým místem a nesmyslnými mutacemi, podrobnosti viz doplňková tabulka 3) pomocí dvouvýběrového T-testu pro 20531 genů. Našli jsme pouze 244 genů s P < 0,01 a 30 genů s P < 0,001, což bylo jen o něco více, než se očekávalo náhodou (205 a 20,5, resp. tabulka 4). Samotný TP53 poskytl nejvýznamnější rozdíl v expresi genů, který byl v průměru téměř 5krát nižší u nádorů s nulovými mutacemi oproti mutacím v kodonu 273 TP53 (doplňková tabulka 4, P = 2 × 10-10). Při analýze PC jsme opět zjistili jen malé rozdělení obou souborů nádorů (doplňkový obr. 7). V souladu s podobným transkripčním podpisem jsme pro 43 pacientů s údaji o přežití sestavili Coxovy modely proporcionálního rizika, přičemž jsme v modelu použili věk, stadium a stav TP53, a nezjistili jsme žádnou významnou souvislost mezi výsledkem pacientů a stavem mutace TP53 (missense mutace R273 vs. nulová mutace, doplňková tabulka 5, P = 0,67 podle Waldova testu). Je třeba zmínit, že při pouhých 7 úmrtích mezi těmito pacienty byla síla pro detekci rozdílů poměrně nízká. Nakonec jsme se podívali na průnik genů, které dávají P < 0,05 v některém ze tří výše popsaných souborů dat (tj. lidské a myší nádory tlustého střeva, myší organoidy tlustého střeva), které se změnily stejným směrem pro srovnání missense Trp53/TP53 vs. nulová mutace. V doplňkové tabulce 4 uvádíme geny, u kterých bylo dosaženo P < 0,05 a změny záhybu alespoň 1,3 v jakýchkoli dvou ze tří datových souborů. Našli jsme pouze Trp53/TP53, který se změnil stejným směrem ve všech třech studiích (Doplňková tabulka 4; podrobné statistiky pro každý gen ve všech třech datových souborech jsou k dispozici v naší veřejné sérii GEO). Celkově naše analýzy genové exprese myších a lidských CRC ukazují, že nádory tlustého střeva s missense nebo nulovými mutacemi Trp53/TP53 R270/R273 mají velmi podobné profily genové exprese, což je v souladu s absencí jakýchkoli zásadních rozdílů v biologických vlastnostech nádorů tlustého střeva a fenotypech vznikajících in vivo u myší AKP270/fl a AKPfl/fl.