Výběr správných restrikčních enzymů na základě definovaných kritérií
Pro stručný příklad byl do alfaretrovirálního vektoru naklonován fluorescenční protein tdTomato. Následně byla vytvořena buněčná linie myší leukémie exprimující tdTomato. Tato buněčná linie bude použita ke sledování nádorových buněk po injekci do myší v preklinických imunoterapeutických studiích. Tato metoda klonování je však použitelná pro jakýkoli jiný gen. Pro zahájení projektu klonování je třeba analyzovat gen zájmu (GOI). Nejprve zkontrolujeme, zda naše anotovaná sekvence obsahuje start kodon (ATG, nejběžnější start kodon) a jeden ze tří stop kodonů (TAA, TAG, TGA). V případě, že byl gen dříve manipulován nebo fúzován s jiným genem (např. prostřednictvím sekvence 2A), stává se, že zájmový gen nemusí mít stop kodon. V takových případech je třeba na konec anotované sekvence přidat stop kodon. Je také výhodné prozkoumat, zda vaše GOI obsahuje otevřený čtecí rámec (ORF). To je důležité, protože častá manipulace se sekvencemi buď pomocí softwaru, nebo klonováním může chybně přidat nebo odstranit nukleotidy. K nalezení ORF v našich plazmidových sekvencích používáme software Clone Manager (SciEd); existuje však několik bezplatných webových stránek, které můžete použít k nalezení ORF, včetně vyhledávače otevřených čtecích rámců NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html).
Gen tdTomato obsahuje start kodon ATG a stop kodon TAA (obrázek 1). Velikost genu tdTomato je 716 bp.
Přehled začátku a konce zájmového genu. (A) Jsou zobrazeny sekvence nukleotidů na začátku a na konci genu tdTomato. Nukleotidy kódujícího řetězce jsou uvedeny tučně (B) Jsou zobrazeny nukleotidové sekvence přímého a zpětného primerů obsahujících správná místa restrikčních enzymů a Kozakova sekvence.
V dalším kroku je třeba navrhnout primery PCR, které obsahují správná místa restrikčních enzymů pro amplifikaci GOI. Pro výběr optimálních restrikčních enzymů je třeba zvážit několik kritérií. Za prvé, vazebná místa pro restrikční enzymy by měla být v ideálním případě dostupná na více klonovacích místech ve vektoru. Alternativně mohou být umístěna za promotorem v sekvenci vašeho vektoru. Restrikční enzymy by měly být jednořezné (jednořezné enzymy se zaměřují pouze na jedno restrikční místo v sekvenci DNA) (obrázek 2A). Pokud jsou to dvojité nebo vícenásobné řezače, měly by řezat v sekvenci, která není nezbytná pro správné fungování vektorového plazmidu, a nakonec budou odstraněny (obrázek 2B). Je také možné zvolit jeden dvojitý nebo vícenásobný řezací enzym, který řeže vektor za promotorem a také ne v rámci životně důležité sekvence plazmidu (obrázek 2C). Enzymy double cutter nebo multiple cutter mají na sekvenci DNA dvě, respektive více restrikčních míst. Při řezání vektoru dvojitými nebo vícenásobnými kutry by vznikly dva identické konce. V takovém případě by vložená kazeta měla rovněž obsahovat stejná místa restrikčních enzymů na obou svých koncích. Proto když jsou fragmenty inzertu a vektoru smíchány při ligačním experimentu, může se inzert spojit s vektorem buď ve správné orientaci (od start kodonu ke stop kodonu), nebo opačně (od stop kodonu ke start kodonu). Třetí scénář může nastat, pokud fragment vektoru vytvoří samoligovací kruh a vůbec vynechá insert. Jakmile byla DNA inkubována s restrikčními enzymy, defosforylace 5′ a 3′ konců vektorového plazmidu pomocí enzymu alkalické fosfatázy výrazně sníží riziko samoligace. Proto je důležité po ligaci fragmentu provést screening klonovacího produktu na tyto tři produkty (správná orientace, obrácená orientace, samoligace).
Výběr správných restrikčních enzymů na základě definovaných kritérií pro klonování pomocí PCR. (A) Dva restrikční enzymy s jedním řezákem (E1 a E2) jsou umístěny za promotorem. (B) Restrikční enzymy E1 a E2 řežou plazmid za promotorem několikrát (zde dvakrát pro každý enzym). (C) Restrikční enzym E1 řeže plazmid za promotorem vícekrát. (D) Produkt PCR, který obsahuje gen tdTomato a místa restrikčních enzymů, byl před extrakcí pro následné aplikace nanesen na gel.
Druhé, kvůli vyšší účinnosti klonování pomocí fragmentů DNA s lepivým koncem je žádoucí, aby alespoň jeden (lépe oba) z restrikčních enzymů byl tzv. sticky-end cutter. Řezače lepivých konců štěpí DNA asymetricky a vytvářejí komplementární kohezivní konce. Naproti tomu štípače tupých konců stříhají sekvenci symetricky a nezanechávají žádné převisy. Klonování fragmentů s tupým koncem je obtížnější. Nicméně volba vyššího molárního poměru insert/vektor (5 nebo více) a použití 10% polyethylenglykolu (PEG) může zlepšit ligaci fragmentů s tupým koncem.
Zatřetí, některé restrikční enzymy nestříhají metylovanou DNA. Většina kmenů E. coli obsahuje metylázy Dam nebo Dcm, které metylují sekvence DNA. Díky tomu jsou odolné vůči restrikčním enzymům citlivým na metylaci. Jelikož se vektorová DNA většinou připravuje v E. coli, bude metylovaná. Proto je žádoucí vyhnout se restrikčním enzymům citlivým na metylaci; někdy je však izochizomer restrikčního enzymu citlivého na metylaci vůči metylaci rezistentní. Například enzym Acc65I je citlivý, zatímco jeho isoschizomer kpnI je vůči metylaci rezistentní. Isoschizomery jsou restrikční enzymy, které rozpoznávají stejné nukleotidové sekvence. Pokud nezbývá jiná možnost než použití restrikčních enzymů citlivých na metylaci, je třeba připravit vektorovou DNA v dam – dcm – kmenech E. coli. Seznam těchto kmenů a také běžných hostitelských kmenů E. coli pro molekulární klonování je shrnut v tabulce 1. Informace týkající se citlivosti restrikčních enzymů k metylaci obvykle poskytuje výrobce.
Za čtvrté, klonování usnadňuje, pokud je pufr potřebný pro plnou funkčnost restrikčních enzymů stejný, protože lze provést dvojí restrikční trávení. To šetří čas a snižuje ztráty DNA při purifikaci. Může se stát, že jeden z restrikčních enzymů je aktivní v jednom pufru a druhý enzym je aktivní v dvojnásobné koncentraci téhož pufru. Například enzym NheI od společnosti Thermo Scientific je aktivní v pufru Tango 1X (Thermo Scientific) a enzym EcoR1 je aktivní v pufru Tango 2X (Thermo Scientific). V takových případech je třeba plazmidovou DNA nejprve natrávit enzymem vyžadujícím vyšší koncentraci pufru (zde EcoR1). Poté bude následovat ředění pufru pro další enzym (vyžadující nižší koncentraci (zde NheI)) ve stejném pufru. Vznik univerzálních pufrů však dvojí trávení sekvencí DNA zjednodušil. V našem příkladu obsahuje vektor restrikční místa AgeI a SalI. Tato enzymová místa byla použita pro návrh primerů PCR (obrázek 1). Pro správné štěpení restrikčními enzymy je nezbytné, aby čistota plazmidu byla vysoká. K určení čistoty po přečištění lze použít absorbanci DNA měřenou spektrofotometrem. DNA, proteiny a rozpouštědla absorbují při 260 nm, 280 nm a 230 nm. Poměr OD 260/280 >1,8 a poměr OD 260/230 2 až 2,2 se u vzorků DNA považuje za čistý. Poměry OD 260/280 a 260/230 našich příkladných plazmidových preparátů byly 1,89, resp. 2,22. Pozorovali jsme, že čistota fragmentů DNA vektoru a inzertu extrahovaných z gelu byla po restrikčním štěpení nižší; ligace funguje i v takových případech, nicméně lepší výsledky lze očekávat při použití fragmentů s vysokou čistotou.
Pro výběr různých vektorů (virová exprese a balení, prázdné páteře, fluorescenční proteiny, indukovatelné vektory, epitopové značky, fúzní proteiny, reportérové geny, druhově specifické expresní systémy, selekční markery, promotory, exprese shRNA a genomové inženýrství) mohou být užitečné následující webové stránky repozitáře plazmidů:http://www.addgene.org/browse/.
Sbírka klonovacích vektorů E. coli je k dispozici pod následující webovou stránkou:http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/cvector/cvectorExplanation.jsp.
Pro návrh primerů PCR zkontrolujte start a stop kodony vaší GOI. Zjistěte sekvenci požadovaných restrikčních enzymů (k dispozici na webových stránkách výrobců) pro dopředný primer (obrázek 3A). Musí být umístěn před GOI (obrázek 1B). Takzvaná Kozakova sekvence se nachází v eukaryotických mRNA a zlepšuje iniciaci translace. Je výhodné přidat Kozakovu sekvenci (GCCACC) před start kodon ATG, protože u eukaryot zvyšuje translaci a expresi zájmového proteinu. Proto jsme vložili GCCACC hned za sekvenci restrikčního enzymu AgeI a před start kodon ATG. Poté se k dopředné sekvenci primeru přidá prvních 18 až 30 nukleotidů GOI počínaje start kodonem ATG. Tyto překrývající se nukleotidy navázané na templátovou DNA určují teplotu žíhání (Tm). Ta je obvykle vyšší než 60 °C. Zde používáme vysoce věrnou DNA polymerázu Phusion (Thermo Scientific). Pro určení optimální Tm můžete použít následující webové stránky:http://www.thermoscientificbio.com/webtools/tmc/.
Navrhování primerů na základě definovaných kritérií pro klonování PCR. (A-B) Jsou znázorněny sekvence přímého a reverzního primeru. Konec kódujícího vlákna je třeba převést do formátu reverzního komplementu pro návrh reverzního primeru. Další informace naleznete v textu.
https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/tm-calculator.
Tm našeho přímého primeru je 66 °C.
Pro návrh reverzního primeru vyberte posledních 18 až 30 nukleotidů včetně stop kodonu vaší GOI (obrázek 3B). Poté vypočítejte Tm pro tuto sekvenci, která by měla být vyšší než 60 °C a blízká Tm přímého primeru. Tm překrývající se sekvence našeho reverzního primeru byla 68 °C. Poté přidejte cílovou sekvenci druhého místa restrikčního enzymu (v tomto případě SalI) bezprostředně za stop kodon. Nakonec tuto sestavenou sekvenci převeďte na reverzně komplementární sekvenci. Pro určení sekvence reverzního primeru lze použít následující webové stránky:
http://reverse-complement.com/
http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.htmlThis je důležité, protože reverzní primer váže kódující vlákno, a proto musí být jeho sekvence (5′ → 3′) reverzně komplementární k sekvenci kódujícího vlákna (obrázek 1A).
Provádění PCR pomocí korektorových polymeráz
Protože reakce PCR probíhá podle logaritmické amplifikace cílové sekvence, bude jakákoli chyba replikace během tohoto procesu amplifikována. Chybovost DNA polymeráz, které neprovádějí korekturu, jako je polymeráza Taq, je přibližně 8 × 10-6 chyb/bp/PCR cyklus; u korekturních enzymů, jako je polymeráza Phusion, se však uvádí chybovost 4,4 × 10-7 chyb/bp/PCR cyklus. Vzhledem k její vyšší věrnosti a zpracovatelnosti byla v tomto příkladu použita polymeráza Phusion DNA. Je třeba poznamenat, že Phusion má jiné teplotní požadavky než ostatní DNA polymerázy. Tm primerů pro Phusion se vypočítává na základě Breslauerovy metody a je vyšší než Tm při použití polymeráz Taq nebo pfu. Abyste dosáhli optimálních výsledků, měli byste Tm vypočítat na základě informací nalezených na internetových stránkách dodavatelů enzymů. Kromě toho vzhledem k vyšší rychlosti Phusion obvykle stačí 15 až 30 sekund na amplifikaci každého kb zájmové sekvence.
Po PCR je třeba produkt naložit na gel (obrázek 2D). Odpovídající pás je třeba rozříznout a extrahovat DNA. Je nezbytné produkt PCR sekvenovat, protože produkt PCR může obsahovat mutace. K dispozici je několik PCR klonovacích souprav, z nichž některé jsou uvedeny v tabulce 2. My jsme použili klonovací vektor pJET1.2/blunt (Thermo Scientific, patentová publikace: US 2009/0042249 A1, přístupové číslo Genbank EF694056.1) a produkt PCR jsme klonovali do linearizovaného vektoru. Tento vektor obsahuje letální gen (eco47IR), který se aktivuje v případě, že se vektor stane cirkulárním. Pokud je však produkt PCR klonován do klonovacího místa uvnitř letálního genu, ten je narušen a umožňuje bakteriím po transformaci růst kolonií. Cirkulované vektory, které neobsahují produkt PCR, exprimují toxický gen, který proto bakterie zabíjí a vylučuje tvorbu kolonií. Bakteriální klony se pak kultivují, plazmidová DNA se postupně izoluje a sekvenuje. Pro optimální výsledky sekvenování je zásadní kvalita izolovaného plazmidu. Izolovali jsme plazmidovou DNA z celkem 1,5 ml kultivovaných bakterií (výtěžek 6 μg DNA; OD 260/280 = 1,86; OD 260/230 = 2,17) pomocí soupravy pro minipřípravu plazmidů (QIAGEN). Celý proces PCR, včetně klonování produktu PCR do sekvenčního vektoru a transfekce bakterií sekvenčním vektorem, lze provést během jednoho dne. Druhý den se bakteriální klony kultivují přes noc, než se odešlou k sekvenování.
Analýza dat sekvenování
Společnosti zabývající se sekvenováním obvykle hlásí data sekvenování jako soubor FASTA a také jako hotové nukleotidové sekvence e-mailem. Pro analýzu sekvencí lze použít následující webové stránky:
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
http://xylian.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi
Zde se zaměříme na první webovou stránku. Na této webové stránce klikněte na možnost „nucleotide blast“ (obrázek 4A). Otevře se nové okno. Ve výchozím nastavení je označena možnost „blastn“ (blast nukleotidových sekvencí) (obrázek 4B). Poté zaškrtněte políčko za „Align two or more sequences“ (zarovnat dvě nebo více sekvencí). Nyní se zobrazí dvě pole. Do pole „Enter Query Sequence“ (zadejte sekvenci dotazu) (horní pole) vložte požadovanou sekvenci genu vašeho zájmu, která je obklopena restrikčními místy, jež jste již navrhli pro primery PCR. Do pole „Enter Subject Sequence“ (Zadejte sekvenci subjektu) (spodní pole) zadejte sekvenci nebo nahrajte soubor FASTA, který jste obdrželi od sekvenační společnosti. Poté klikněte na tlačítko „BLAST“ ve spodní části stránky. Po několika sekundách se výsledky zobrazí na další stránce. Část údajů o zarovnání je zobrazena na obrázku 4C. Pro interpretaci je třeba vzít v úvahu následující body: 1) počet identických nukleotidů (uvedený v položce „Identity“) se musí rovnat počtu nukleotidů vašeho zájmového genu. V našem příkladu byl počet nukleotidů genu tdTomato spolu s nukleotidy míst restrikčních enzymů a Kozakovou sekvencí 735. To se rovná uváděnému počtu (obrázek 4C). 2) Identita sekvence (v položce „Identity“) by měla být 100 %. Občas se stává, že identita sekvence je 100 %, ale počet identických nukleotidů je nižší, než se očekává. K tomu může dojít, pokud chybí jeden nebo více výchozích nukleotidů. Nezapomeňte, že všechny technologie sekvenování mají určitou chybovost. U Sangerova sekvenování se tato chybovost uvádí v rozmezí od 0,001 % do 1 %. Nukleotidovou substituci, deleci nebo inzerci lze identifikovat analýzou výsledků sekvenování. Pokud tedy identita sekvence nedosahuje 100 %, měl by být plazmid resekvenován, aby se odlišily chyby PCR od prostých chyb sekvenování. 3) Mezery (v položce „Gaps“) by se neměly vyskytovat. Pokud se mezery objeví, měl by být plazmid resekvenován.
Sekvenční analýza produktu PCR pomocí platformy NCBI BLAST. (A) Na webové stránce NCBI BLAST je zvolena možnost „nucleotide blast“ (označená oválnou čarou). (B) Ve výchozím nastavení se zobrazí možnost „blastn“ (označeno kroužkem). Do políček „Enter Query Sequence“ (Zadejte sekvenci dotazu) a „Enter Subject Sequence“ (Zadejte sekvenci subjektu) se vloží sekvence zájmového genu (lemovaná restrikčními místy podle předchozího návrhu primerů PCR) a produkt PCR. Sekvence lze také nahrát jako soubory FASTA. (C) Je zobrazeno zarovnání nukleotidů prvních 60 nukleotidů. Dvě položky důležité pro sekvenční analýzu jsou označeny oválnými čarami.
Průměrná délka čtení neboli délka čtení je při Sangerově sekvenování nejméně 800 až 900 nukleotidů. Pro vektor pJET je třeba pro sekvenování celého genu použít jeden přímý a jeden zpětný primer. Tyto primery mohou obvykle pokrýt gen o velikosti až 1800 bp. Pokud je velikost genu větší než 1800, je třeba navrhnout další primer pro každých 800 nukleotidů navíc. Protože spolehlivé volání bází nezačíná hned za primerem, ale asi 45 až 55 nukleotidů za primerem, měl by být další dopředný primer navržen tak, aby začínal asi po 700 nukleotidech od začátku genu. K návrhu těchto primerů lze použít různé webové stránky, včetně následujících:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer
http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/sequencing_primer_design
Při délce 735 bp byla velikost produktu PCR v tomto příkladu v rozsahu primerů pro sekvenování pJET.
Po výběru sekvenčně ověřeného klonu byly vektor a vložený plazmid natráveny restrikčními enzymy AgeI a SalI (obrázek 5). Následovala gelová purifikace a ligace fragmentů. Transformace kompetentní E. coli s ligační směsí poskytla několik klonů, které byly prověřeny restrikčními enzymy. Vyhodnotili jsme osm klonů, z nichž všechny obsahovaly insert tdTomato (obrázek 6). Je důležité vybrat klony, které jsou velké. Satelitní klony by nemusely mít správný konstrukt. K extrakci plazmidu z 0,6 ml bakteriální suspenze jsme použili soupravu pro rychlou minipřípravu plazmidu (Zymo Research). Výtěžek a čistota byly vyhovující pro screening založený na restrikčních enzymech (2,3 μg DNA; OD 260/280 = 1,82; OD 260/230 = 1,41). Pro rozsáhlou purifikaci plazmidu byla použita sada maxi-preparation (QIAGEN) k extrakci plazmidu ze 450 ml bakteriální kultury (výtěžek 787 μg DNA; OD 260/280 = 1,89; OD 260/230 = 2,22). Očekávaný výtěžek izolace plazmidu odvozeného od pBR322 z 1,5 ml a 500 ml bakteriální kultury je přibližně 2-5 μg, resp. 500-4000 μg DNA.
Mapy vektoru a vloženého plazmidu A) Ilustrace plazmidu CloneJET obsahujícího produkt PCR. Vložení produktu PCR do klonovacího místa plazmidu naruší integritu toxického genu eco47IR a umožní růst transgen pozitivních klonů. Plazmid byl rozřezán pomocí enzymů AgeI a SalI za vzniku dvou fragmentů o velikosti 3 kb a 0,7 kb. Fragment o velikosti 0,7 kb (gen tdTomato) byl použit jako insert pro klonování. (B) Ilustrace vektorového plazmidu. Plazmid byl rozřezán pomocí enzymů AgeI a SalI za vzniku dvou fragmentů o velikosti 4,9 kb a 0,7 kb. Fragment o velikosti 4,9 kb byl použit jako vektor pro klonování. AMP: Gen rezistence vůči ampicilinu; PRE: posttranskripční regulační prvek; MPSV: promotor viru myeloproliferativního sarkomu.
Screening konečného plazmidu restrikčními enzymy. Zobrazena je ilustrace finálního plazmidu. Pro screening byl plazmid rozřezán enzymem BsiwI za vzniku dvou fragmentů o velikosti 4,8 kb a 0,8 kb. AMP:
Některé plazmidy mají tendenci rekombinovat uvnitř bakteriálního hostitele a vytvářet inzerce, delece a rekombinace. V těchto případech může být užitečné použití E. coli s deficitem recA (tabulka 1). Navíc, pokud je GOI toxická, inkubace bakterií při nižších teplotách (25-30 °C) a použití kmenů ABLE C nebo ABLE K může tento problém obejít.
Tvorba viru a transdukce cílových buněk
Pro zkoumání exprese klonovaného genu in vitro byly buňky HEK293T transfekovány plazmidy kódujícími gen tdTomato, alfaretrovirový Gag/Pol a obal glykoproteinu viru vezikulární stomatitidy (VSVG). Tyto buňky, které jsou odvozeny z lidských embryonálních ledvin, jsou snadno kultivovatelné a snadno transfekovatelné. Proto se hojně využívají v biotechnologiích a genové terapii ke generování virových částic. Buňky HEK293T vyžadují dělení každý druhý den za použití teplého média. Pro dosažení optimálních výsledků by neměly dosáhnout 100% konfluence. Pro dobrou účinnost transfekce je třeba tyto buňky kultivovat alespoň jeden týden, aby byly v logaritmické fázi. Účinnost transfekce byla 22 %, jak bylo stanoveno na základě exprese tdTomato pomocí fluorescenční mikroskopie po 24 hodinách (obr. 7A-B). Pro vytvoření buněčné linie myší leukémie exprimující gen tdTomato pro studie imunoterapie byly leukemické buňky C1498 transdukovány čerstvě odebraným virem (36 hodin po transfekci). Zobrazovací studie (Obrázek 7C) a průtoková cytometrická analýza (Obrázek 7D) čtyři dny po transdukci potvrdily expresi tdTomato u většiny buněk.
Hodnocení exprese klonovaného genu in vitro. (A, B) Buňky HEK293T byly transfekovány plazmidy Gag/Pol, VSVG a tdTomato. Exprese genu tdTomato byla hodnocena pomocí fluorescenčního mikroskopu. Fluorescenční snímky byly superponovány na snímek v jasném poli pro rozlišení pozitivně transdukovaných buněk. Účinnost transfekce byla stanovena na základě exprese tdTomato po 24 hodinách. Jako kontrola byly použity netransfekované buňky HEK293T (modrý histogram). (C, D) Myší leukemická buněčná linie C1498 byla transdukována čerstvým virem. O čtyři dny později byla exprese transgenu hodnocena pomocí fluorescenční mikroskopie (C) a průtokové cytometrie (D). Jako kontrola byly použity netransdukované buňky C1498 (modrý histogram). Měřítka představují 30 μm.
.
Napsat komentář