Molekulární identifikace druhů Mycobacterium s veřejným zdravotním a veterinárním významem ze skotu v jižním státě Mexika

Abstrakt

Rod Mycobacterium způsobuje řadu zoonotických onemocnění. Nejznámějším příkladem je zoonotická tuberkulóza způsobená M. bovis. Mnohem méně je známo o „netuberkulózních mykobakteriích“ (NTM), které jsou rovněž spojovány s infekcemi u lidí. Mexická norma NOM-ZOO-031-1995 upravuje přítomnost M. bovis u skotu; pro druhy NTM však žádný předpis neexistuje. Cílem této studie bylo izolovat a identifikovat netuberkulózní druhy mykobakterií ze skotu z místních stád v jižní oblasti státu Mexiko prostřednictvím identifikace a detekce 100 bp molekulárního markeru v genu 23S rRNA s následným sekvenováním genu 16S rRNA. Byly odebrány vzorky mléka (35) a vzorky nosního exsudátu (68). Ze 108 izolovaných kmenů bylo 39 vybráno k identifikaci. Třináct kmenů izolovaných z nosních exudátů amplifikovalo 100 bp molekulární marker a bylo identifikováno jako M. neoaurum (šest kmenů), M. parafortuitum (čtyři kmeny), M. moriokaense (dva kmeny) a M. confluentis (jeden kmen). S výjimkou M. parafortuitum jsou ostatní identifikované druhy předmětem veřejného zdravotního a veterinárního zájmu, protože jsou patogenní pro člověka, zejména pro osoby se základním onemocněním

1. Úvod

Rod Mycobacterium způsobuje širokou škálu zoonotických onemocnění. Nejznámějším příkladem je zoonotická tuberkulóza způsobená M. bovis, jejímž hlavním rezervoárem je skot. M. bovis je součástí „tuberkulózního komplexu“, který zahrnuje také druhy M. tuberculosis, M. africanum, M. caprae a M. microti .

Ve skupině mykobakterií jsou „netuberkulózní mykobakterie (NTM)“, které jsou také spojovány s infekcemi u lidí. NTM se vyskytují v různých zdrojích prostředí, jako je půda, voda, vegetace, zvířata, mléčné výrobky a výkaly, a mohou se přenášet neúmyslně vdechnutím, požitím nebo proniknutím kůží .

Mexická norma NOM-ZOO-031-1995 upravuje přítomnost M. bovis u skotu za účelem kontroly a eradikace bovinní tuberkulózy (bTB); pro druhy NTM však žádný předpis neexistuje. Oficiální diagnostika tuberkulózy skotu v důsledku přítomnosti M. bovis v terénu je založena na intradermálním testu s použitím purifikovaného proteinového derivátu (tuberkulinu) . Přestože se tento test používá již několik let, neposkytuje dobrou citlivost a specifičnost. Přibližně 20 % zvířat s tuberkulózou na test nereaguje , a přítomnost jiných druhů mykobakterií, jak tuberkulózního komplexu, tak druhů NTM, způsobuje interference, které vedou k falešně pozitivním a falešně negativním diagnózám.

Ačkoli Mexiko má regulační normu, v některých oblastech je hlášena prevalence bTB přesahující 2 % . Vzhledem k nízké specificitě a citlivosti tuberkulinového testu je skutečná přítomnost M. bovis pravděpodobně nižší a míra infekce skotu jinými mykobakteriemi pravděpodobně vyšší, resp. Chovatelé skotu, veterinární lékaři, technici a zaměstnanci pracující v živočišné výrobě tak mohou být profesně vystaveni infekci M. bovis a NTM. O profesní expozici zoonózám způsobeným druhy NTM je známo jen velmi málo, protože identifikace těchto druhů byla před rozvojem identifikačních technik založených na molekulární biologii poměrně obtížným úkolem.

V současné době se pro diagnostiku onemocnění způsobených mykobakteriemi nejčastěji používají molekulárně biologické techniky: polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) pro diagnostiku M. bovis a NTM. tuberculosis , spoligotyping pro diagnostiku M. bovis a detekce „specifické inzerce“ o velikosti 100 párů bází (bp) umístěné na genu 23S rRNA charakteristické pro grampozitivní bakterie s vysokým obsahem guaninu a cytozinu (HGC), která je považována za molekulární marker pro tuto skupinu bakterií , a dále sekvenční analýza genu 16S rRNA pro identifikaci bakterií na druhové úrovni.

Mezi druhy NTM identifikované výše uvedenými technikami patří M. balnei, M. marinum a M. platypoecilus, které způsobily povrchové a hluboké kožní léze ; M. kansasii z plicních lézí ; M. simiae z generalizovaných infekcí ; M. scrofulaceum z infekcí kůže a vnitřních orgánů ; M. szulgai z plicních infekcí, osteomyelitidy, tenosynovitidy a lymfadenitidy ; M. ulcerans z podkožních granulomů ; M. fortuitum a M. chelonae spojené s vaskulitidou, endokarditidou, osteomyelitidou, mediastinitidou, meningitidou, keratitidou a hepatitidou ; M. abscessus spojený s erytematózními lézemi, které přecházejí ve vředovité uzliny ; a další druhy.

Největší procento státního inventáře pro hlavy skotu ve státě Mexiko v Mexiku je soustředěno v jižní oblasti a jednou z hlavních hospodářských činností je chov skotu . Mexický předpis pro kontrolu skotu NOM-ZOO-031-1995 se zaměřuje pouze na tuberkulinový test pro diagnostiku M. bovis. O výskytu NTM u skotu v tomto regionu je známo jen málo. Vzhledem k možnosti identifikace druhů aktinobakterií pomocí detekce 100 párů bází molekulárního markeru na genu 23S rRNA a následného sekvenování genu 16S rRNA je možné identifikovat výše zmíněné druhy NTM.

Cílem této studie bylo izolovat a identifikovat druhy NTM ze skotu z jižní oblasti státu Mexiko. Druhy mykobakterií byly izolovány ze vzorků nosního exsudátu a hovězího mléka a identifikovány pomocí detekce 100 párů bází molekulárního markeru v genu 23S rRNA s následným sekvenováním genu 16S rRNA.

2. Materiál a metody

2.1. Materiál a metody

2.2. Metodika a metodika. Odběr vzorků

Odběr vzorků byl proveden na základě prostorového rozložení stád pozitivních na tuberkulózu skotu ve státě Mexiko, které provedli Zaragoza et al. 2015 . Byla vybrána čtyři stáda skotu v jižní oblasti státu Mexiko, jedno stádo patřící do obce Temascaltepec a tři stáda patřící do obce Zacazonapan. Celkem bylo odebráno 103 vzorků, 35 vzorků mléka a 68 vzorků nosního exsudátu. Rozdělení počtu a typu vzorků odebraných v jednotlivých stádech je uvedeno v tabulce 1.

2.2. Výskyt tuberkulózy skotu. Získání vzorků mléka a nosního exsudátu

Vemeno a bradavky byly očištěny čištěnou vodou a mýdlem a poté osušeny papírovými ručníky a následně byla provedena asepse bradavek pomocí tamponů namočených v 70% alkoholu. Pět mililitrů mléka bylo odebráno přímo z bradavky do sterilních 20ml nádobek, přičemž počáteční tok byl vyřazen. Nosní exsudát byl odebrán přímo z vnitřní strany nosního otvoru pomocí 10 cm dlouhého sterilního tamponu, který byl následně ponořen do izotonického fyziologického roztoku (0,85 %). Vzorky mléka a nosního exsudátu byly až do zpracování uchovávány při teplotě 4 °C.

2.3 Vzorky mléka a nosního exsudátu byly uchovávány při teplotě 4 °C. Zpracování vzorků

2.3.1. Izolace mykobakterií

Vzorky mléka byly odstřeďovány při 2500 otáčkách za minutu (rpm) po dobu 10 minut. Pelety ze vzorků mléka a nosního exsudátu byly naočkovány do následujícího kultivačního média selektivního pro mykobakterie: (BD BBL 220504), Middlebrook (BD BBL 254521) a Middlebrook (BD BBL 254521) doplněné 6 g pyruvátu sodného na litr (Middlebrook-P). Naočkovaná média byla inkubována při 37 °C po dobu 8 týdnů a každé 3 dny byla hodnocena.

2.3.2. Klasifikace izolovaných kmenů

Izolované kmeny byly rozděleny do skupin podle následujících charakteristik: pigmentace kolonií, doba růstu a vlastnosti kolonií (tvar, konzistence, textura a produkce pigmentu). Izolované kmeny byly obarveny pomocí Ziehl-Neelsenova barviva, aby se potvrdila přítomnost acidofastických bacilů (AFB) .

2.4. Kmeny, které byly izolovány, byly obarveny pomocí Ziehl-Neelsenova barviva. Extrakce DNA

K identifikaci byly vybrány kmeny s mikroskopickými charakteristikami podobnými mykobakteriím (acidofastická pozitivita) a dva reprezentativní kmeny z každé skupiny. Pro získání biomasy byly kmeny inokulovány do 30 ml tekutého kultivačního média Middlebrook (BD BBL 254521) v baňkách o objemu 125 ml a inkubovány při 37 °C po dobu 7 dnů. Tekuté médium bylo převedeno do sterilních 15 ml zkumavek Falcon a odstřeďováno 15 minut při 14 000 otáčkách za minutu. Poté byl supernatant odstraněn a peleta byla přenesena do 1,5 ml zkumavek Eppendorf; zkumavky byly poté centrifugovány při 14 000 otáčkách za minutu × 5 minut a supernatant byl zlikvidován. Ze vzniklého peletu byla provedena extrakce DNA pomocí soupravy Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega A1120)

2.5. Detekce molekulárního markeru v genu 23S rRNA

Molekulární marker o velikosti 100 bp umístěný na genu 23S rRNA byl amplifikován podle metodiky popsané Rollerem et al. (1992) s použitím následujících primerů : 23S InsF, 5′-(AC)A(AGT)GCGTAG(AGCT)CGA(AT)GG-3′, a 23S InsR, 5′-GTG(AT)CGGTTT(AGCT)(GCT)GGTA-3′.

Reakce byla provedena pomocí komerční Taq DNA polymerázy (Promega M1661). Byly použity následující tepelné podmínky cyklu: krok přednasycení po dobu 5 minut (94 °C); 29 cyklů denaturace po dobu 30 sekund (94 °C), hybridizace po dobu 45 sekund (46 °C) a elongace po dobu 50 sekund (72 °C); a nakonec cyklus po elongaci po dobu 5 minut (72 °C). Amplifikované fragmenty byly potvrzeny na 2% agarózovém gelu obarveném ethidium bromidem (SIGMA 46065).

2.6. Amplifikace genu 16S rRNA

Kmeny, které amplifikovaly 100 bp fylogenetického markeru, byly vybrány pro sekvenační analýzu 16S rRNA. Pro amplifikaci byly použity následující primery: 8f: AGAGTTTGATCMTGGCTCAG a 1492r:

Reakce byla provedena pomocí komerční Taq DNA polymerázy (Promega M1661). Byly použity následující tepelné podmínky cyklu: jeden krok přednasycení po dobu 5 minut (94 °C); 34 cyklů denaturace po dobu 30 sekund (94 °C), hybridizace po dobu 20 sekund (52 °C) a elongace po dobu 1 minuty 30 sekund (72 °C); a nakonec postlongační cyklus po dobu 7 minut (72 °C).

Amplifikované fragmenty byly potvrzeny na 1% agarózovém gelu obarveném ethidium bromidem (SIGMA 46065). Produkty této amplifikace byly přečištěny pomocí soupravy Amicon Ultra Filter® (Millipore UFC901008) a potvrzeny na 1% agarózovém gelu, aby se ověřila jejich přítomnost a kvalita.

2.7. Amplifikace a purifikace produktů. Identifikace druhů mykobakterií

Amplifikované produkty genu 16S rRNA byly odeslány do Macrogen Sequencing Service, Maryland, USA. Získané sekvence byly analyzovány a opraveny pomocí programu BioEdit . Z dopředných a reverzních fragmentů byly sestaveny konsenzuální sekvence, které byly porovnány se sekvencemi dříve uloženými v GenBank Národního centra pro biotechnologické informace (NCBI) pomocí programu BLAST a EzTaxon 2.1 .

2.8 . Fylogenetická analýza

Sekvence genu 16S rRNA byly získány pro následující druhy mykobakterií z American Type Culture Collection (ATCC) a German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSM): M. neoaurum ATCC25795, M. parafortuitum DSM43528, M. moriokaense , a M. confluentis . Sekvence sbírkových kmenů a sekvence kmenů izolovaných v rámci tohoto šetření byly srovnány pomocí programu BioEdit . Fylogenetická analýza byla provedena pomocí metody maximální parsimonie v softwaru MEGA verze 4 . Pro vytvoření kořene kladogramu byla použita sekvence Pantoea agglomerans DSM 3493.

3. Výsledky

Stoosm kmenů izolovaných ze 103 odebraných vzorků bylo rozděleno do 13 skupin podle makroskopických a mikroskopických morfologických charakteristik (tabulka 2). Zejména skupiny 11 a 12 byly tvořeny acidofastickými kmeny.

Pro identifikaci na druhové úrovni bylo vybráno 39 kmenů: 10 z nich patřilo do skupiny 11 a 7 do skupiny 12.

K identifikaci na druhové úrovni bylo vybráno 39 kmenů. Pro doplnění 39 kmenů byly vybrány dva kmeny z každé ze zbývajících 11 skupin. Molekulární marker 100 bp byl nalezen u 33 % (13/39) vybraných kmenů. U nich byl amplifikován gen 16S rRNA pro sekvenování a identifikaci na druhové úrovni.

Celková prevalence NTM na odebraných vzorcích byla 12,6 % (13/103) s ohledem na vzorky mléka i nosního exsudátu. Specifická prevalence pro vzorky nosního exsudátu však byla 19,1 % (13/68).

Podle porovnání sekvencí byly identifikovány čtyři druhy NTM rodu Mycobacterium; 64 % (6/13) kmenů mělo 98 % a 99 % podobnost s kmeny M. neoaurum, zatímco 31 % (4/13) mělo 99% podobnost s M. parafortuitum, 15 % (2/13) mělo 98% a 99% podobnost s M. moriokaense a konečně 8 % (1/13) mělo 99% podobnost s M. confluentis (tabulka 3).

Byl vytvořen fylogenetický strom s rodem Mycobacterium a čtyřmi jeho druhy, pomocí kterého byly pozorovány fylogenetické vztahy mezi sbírkovými kmeny a kmeny izolovanými v tomto šetření (obrázek 1).

Obrázek 1

Fylogenetický strom sestavený porovnáním sekvencí genu 16S rRNA z izolovaných a referenčních kmenů.

4. Diskuse

Druhy NTM byly izolovány pouze ze vzorků nosního exsudátu, čímž byly vyloučeny vzorky z jedné z místních farem této studie (tabulka 1). Zjistili jsme, že specifická prevalence byla 19,1 % ve stádech v jižní oblasti státu Mexiko. Podobné studie ve Spojených státech, Jižní Africe, Tanzanii a Brazílii uvádějí hodnoty prevalence NTM 3,4 %, 24,5 %, 7 % a 7,8 %; hodnota prevalence zjištěná v této studii tedy leží v rozmezí dříve uváděných hodnot . V této studii bylo 13 z 39 analyzovaných kmenů identifikováno jako NTM druhů M. neoaurum, M. moriokaense, M. confluentis a M. parafortuitum.

M. neoaurum, člen komplexu Mycobacterium parafortuitum, je zodpovědný za široké spektrum onemocnění, z nichž většina souvisí s infekcemi zařízení, jako jsou katétry Hickman, katétry BROVIAC, PICC linky , arteriovenózní píštěle, které zahrnovaly polytetrafluorethylenový štěp , pace makery a endokarditida protetických chlopní. Hlavními hostiteli jsou imunokompromitovaní pacienti držící tato zařízení, například pacienti trpící rakovinou a diabetici se selháním ledvin a srdečními problémy . M. neoaurum byl rovněž izolován od pacientů s močovými infekcemi , meningoencefalitidou a změnami v centrálním nervovém systému , bakteriemií a endokarditidou a plicní infekcí . Ačkoli byl izolován především z klinických případů, existují také zprávy o jeho izolaci z mléka a skotu .

M. moriokaense byl izolován ze vzorku sputa . Ačkoli je považován za nepatogenní pro člověka, byl spojován s plicními onemocněními . M. confluentis byl izolován také ze vzorků sputa , a spolu s M. parafortuitum jsou oba považovány za nepatogenní druhy. M. confluentis, M. moriokaense a M. neoaurum byly izolovány z různých tkání skotu a volně žijících zvířat s tuberkulózními lézemi, zatímco M. parafortuitum byl izolován pouze z mléka skotu . V naší práci však bylo M. parafortuitum izolováno pouze ze vzorků nosního exsudátu.

Výživové nároky mykobakterií se u různých druhů liší, což bylo důvodem použití různých kultivačních médií. Pozoruhodné je, že sedm ze 13 kmenů identifikovaných v této studii bylo izolováno na médiu Stonebrink, včetně M. neoaurum, M. parafortuitum a M. moriokaense. Tento výsledek je v souladu s výsledkem popsaným Sepúlvedou et al., kteří uvedli, že Stonebrinkovo médium je vhodné pro obnovu různých druhů rodu Mycobacterium. García-Martos a García-Agudo uvedli, že Middlebrookovo médium je optimální pro izolaci aktinomycet, což je v souladu s tímto šetřením vzhledem k tomu, že na tomto médiu byly izolovány dva druhy, M. neoaurum a M. parafortuitum. Pozoruhodné je, že M. confluentis byl izolován pouze v Middlebrookově médiu doplněném pyruvátem sodným; strategie použití různých kultivačních médií byla tedy vhodná, protože umožnila izolaci různých druhů rodu Mycobacterium.

Detekce molekulárního markeru přítomného v genu 23S rRNA grampozitivních bakterií s obsahem HGC umožnila rozlišit kmeny eubakterií a mykobakterií. Sekvenační analýza genu 16S rRNA umožnila identifikaci na druhové úrovni, proto je kombinace těchto metodik vhodná pro identifikaci druhů NTM.

5. Zjistili jsme, že v případě NTM se jedná o mikroorganismy. Závěry

Pomocí metodiky popsané v této studii byly izolovány a identifikovány čtyři druhy NTM: M. confluentis, M. moriokaense, M. neoaurum a M. parafortuitum. Tyto druhy byly poprvé izolovány z nosních exudátů skotu z jižní oblasti státu Mexiko. Tři z identifikovaných druhů (M. neoaurum, M. moriokaense a M. confluentis) mají zdravotnický a veterinární význam.

Zveřejnění

Tato práce vychází z disertační práce pro získání titulu doktora zdravotnických věd (Universidad Autónoma del Estado de México), zapsané v PNPC-CONACYT.

Střet zájmů

Všichni autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů.

Poděkování

Autoři by chtěli poděkovat za finanční pomoc tajemníkovi pro výzkum a pokročilá studia Universidad Autónoma del Estado de México (UAEMex) prostřednictvím následujících výzkumných grantů: (i) „Implementation of Geographic Information Systems and Techniques of Molecular Biology, as tools in the detection and identification of Mycobacterium spp.“, SIEA-UAEM 3486/2013CHT, a (ii) sítě „Microbiología y química en las Ciencias de la Salud“, 039/2014RIF.

.