Výsledky
Pro zjištění maximální emisní vlnové délky pro sledování intenzity fluorescence AMC po štěpení trypsinem byla změřena excitační a emisní spektra, která jsou uvedena na obrázku 1. Bylo zjištěno, že maximální emisní vlnová délka je 440 nm.
Pro standardizaci naměřené intenzity fluorescence roztoku enzymu na koncentraci izolovaného AMC byla provedena titrace a změřena fluorescence. K 2,5 ml roztoku enzymu byly přidány alikvoty 0,5 ml roztoku AMC o koncentraci 50 µmol/l a počáteční a konečné koncentrace izolovaného AMC jsou shrnuty v tabulce 1.
Tabulka 1. Koncentrace izolovaného AMC před a po standardizaci intenzity fluorescence.
| Počáteční koncentrace | 3 | 6 | 15 | 30 | 60 | 120 | 240 |
| Konečná koncentrace | 0.5 | 1 | 2,5 | 5 | 10 | 20 | 40 |
Kinetika trypsinové aktivity pak byla získána měřením intenzity fluorescence izolované AMC při štěpení trypsinu ze substrátu. Obrázek 2 ukazuje časový průběh měření po přidání 0,5 ml různých koncentrací roztoku substrátu Boc-Gln-Ala-Arg-MCA k 2,5 ml roztoku enzymu.
Pomocí programu Kinetics Analysis byl z měření časového průběhu fluorescence na obrázku 2 vynesen Lineweaverův-Burkův graf (obrázek 3). Lineweaverův-Burkův graf poskytuje kinetické parametry enzymu, jako je maximální rychlost reakce, Vmax, a Michaelisova-Mentenova konstanta, Km. Vmax popisuje rychlost reakce při nasycení enzymu substrátem, zatímco Km udává množství substrátu k dosažení maximální rychlosti reakce. Vmax byla 35,270 nmol/l-min-1 a Km byla 5,99. Rovnice přímky byla 1/v = 0,000270 – 1/ + 0,0000284.
.
Napsat komentář