Metody, techniky a protokoly imunocytochemie

ICC Main Page > Fixace buněk

Pro zajištění volného přístupu protilátky k jejímu antigenu musí být buňky fixovány a permeabilizovány. Obecně platí, že síla a doba fixace jsou u buněk podstatně kratší než u silnějších, strukturálně složitých tkáňových řezů. Pro imunocytochemii příprava vzorku v podstatě zahrnuje fixaci cílových buněk na podložní sklíčko. Dokonalá fixace by měla imobilizovat antigeny a zároveň zachovat autentickou buněčnou a subcelulární architekturu a umožnit neomezený přístup protilátek ke všem buňkám a subcelulárním kompartmentům. Běžně se používá široká škála fixačních prostředků a správná volba metody závisí na povaze zkoumaného antigenu a na vlastnostech použité protilátky. Fixační metody se obecně dělí do dvou tříd: organická rozpouštědla a síťovací činidla. Organická rozpouštědla, jako jsou alkoholy a aceton, odstraňují lipidy a dehydratují buňky, přičemž srážejí proteiny na buněčné struktuře. Síťovací činidla (např. paraformaldehyd) vytvářejí mezimolekulární můstky, obvykle prostřednictvím volných aminoskupin, a vytvářejí tak síť spojených antigenů. Síťovací činidla zachovávají buněčnou strukturu lépe než organická rozpouštědla, ale mohou snížit antigenicitu některých buněčných složek a vyžadují přidání permeabilizačního kroku, aby byl umožněn přístup protilátky ke vzorku. Fixace oběma metodami může denaturovat proteinové antigeny, a proto mohou být pro barvení buněk užitečnější protilátky připravené proti denaturovaným proteinům. Jsou popsány různé fixační metody. Vhodnou fixační metodu je třeba zvolit podle příslušné aplikace.

1. Fixace acetonem

  • Fixujte buňky v acetonu o teplotě -20 °C po dobu 5-10 minut.

  • Po fixaci acetonem není nutný žádný permeabilizační krok.

2. Fixace metanolem

  • Fixujte buňky v metanolu o teplotě -20 °C po dobu 5-10 minut.

  • Po fixaci metanolem není nutný žádný permeabilizační krok.

3. Fixace etanolem

  • Fixujte buňky v chlazeném 95% etanolu, 5% ledové kyselině octové po dobu 5-10 minut.

4. Fixace metanolem a acetonem

  • Fixace v chlazeném metanolu, 10 minut při -20 °C.

  • Odstraňte přebytečný metanol.

  • Permeabilizujte vychlazeným acetonem po dobu 1 minuty při teplotě -20 °C.

5. Vychladlý methanol a aceton na 1 minutu. Fixace směsí methanolu a acetonu

  • Směs methanolu a acetonu v poměru 1:1.

  • Připravte čerstvou směs a fixujte buňky při -20 C po dobu 5-10 minut.

6. Fixace směsí methanolu a ethanolu

  • směs methanolu a ethanolu v poměru 1:1.

  • Směs připravte čerstvou a fixujte buňky při -20 C po dobu 5-10 minut.

7. Fixace formalínem

  • Fixujte buňky v 10% neutrálním pufru formalínu po dobu 5-10 minut.

  • Krátce opláchněte PBS.

  • Permeabilizujte 0,5% Tritonem X-100 po dobu 10 minut.

8. Paraformaldehydová-Tritonová fixace

  • Fixujte ve 3-4% paraformaldehydu po dobu 10-20 minut.

  • Krátce opláchněte PBS.

  • Permeabilizujte 0,5 % Tritonem X-100 po dobu 10 minut.

9. V případě, že je to nutné, použijte PBS. Fixace paraformaldehydem a metanolem

  • Fixovat ve 4% paraformaldehydu po dobu 10-20 minut.

  • Krátce opláchnout PBS.

  • Permeabilizovat vychlazeným metanolem po dobu 5-10 minut při -20 °C.

.