Materiály

Čistý duloxetin (DLX) byl laskavě poskytnut jako dárkové vzorky společností Lupin Pharmaceuticals, Mumbai, Indie. Hydroxypropylmethylcelulosa (HPMC) tříd 100 M, 4CM a 15 M CR byla velkoryse poskytnuta společností Panacea Biotech Limited, R&D Center, Lalru, Punjab, Indie. Všechny ostatní laboratorní chemikálie a činidla použitá ve studii byla analytické reagenční třídy. V průběhu studie byla použita dvakrát destilovaná voda. Polyethylenglykol 400 byl zakoupen od společnosti S.D. Fine Chem Ltd., Boisar, Indie. Hydrogenfosforečnan disodný, dihydrogenfosforečnan draselný a hydroxid sodný byly zakoupeny od společnosti CDH Ltd., New Delhi, Indie. Absolutní etanol byl získán od Changshu Yangyuan Chemical, Čína. n-ktanol byl zakoupen od E-Merck (India) Ltd., Bombaj, Indie. Dialyzační membrána150 byla zakoupena od společnosti Hi Media Laboratories Ltd., Bombaj. Všechny materiály a prášky byly skladovány ve vakuu při pokojové teplotě.

Vybavení

UV spektra byla zaznamenána na UV/viditelném spektrofotometru Perkin Elmer lambda 15 v UV/viditelném rozsahu 190 až 600 nm. Sestava Franzovy difuzní cely byla pořízena od společnosti Permegear, Inc. v USA. Infračervený spektrofotometr FT-IR-8300 byl získán ze spektrofotometru Perkin Elmer PE RX 1 FTIR. Spektra diferenční skenovací kalorimetrie (DSC) byla získána pomocí DSC modelu Q20 V24.2 Build 107 (Universal V4.5A TA Instruments). Výzkumná odstředivka byla od firmy REMI Equipments, Mumbai, Indie. pH metr CyberScan pH 510 byl pořízen od firmy Eutech Instruments, Indie.

Preformulační studie

Příprava fosfátového pufru s fyziologickým roztokem o pH 7. Příprava roztoku byla provedena v laboratoři.4

0,19 g dihydrogenfosforečnanu draselného, 2,38 g hydrogenfosforečnanu disodného a 8,0 g NaCl bylo rozpuštěno v destilované vodě a objem byl doplněn destilovanou vodou na 1000 ml. pH pufru bylo upraveno na 7,4.

Kvantifikace duloxetin-hydrochloridu

Obsah duloxetinu byl analyzován UV spektrofotometrickou analýzou ve fosfátovém pufru fyziologického roztoku pH 7,4. Skenování zásobního roztoku bylo provedeno v UV oblasti 190 až 400 nm. λ max bylo dosaženo při vlnové délce 289 nm. Zásobní roztok A (250 μ/ml) duloxetin-hydrochloridu byl připraven rozpuštěním 0,0250 g léčiva ve fosfátovém pufru (pH 7,4) do 100 ml. Dále byly ředěním zásobních roztoků A a B fosfátovým pufrem (pH 7,4) připraveny sériové roztoky duloxetinu v rozmezí od 1 μg/ml do 100 μg/ml. Hodnoty absorbance ředění byly zaznamenány při λ max DLX, tj, 289 nm proti fyziologickému roztoku s fosfátovým pufrem (pH 7,4), který byl brán jako slepý pokus, a byla sestrojena kalibrační křivka.

Fyzikálně-chemická charakterizace duloxetin-hydrochloridu

Stanovení teploty tání

Malé množství duloxetin-hydrochloridu bylo odebráno do kapilární zkumavky (na jednom konci zatavené) a vloženo do přístroje pro stanovení teploty tání a byla zaznamenána teplota tání. Pro tento účel byla provedena tři samostatná měření a byla získána jejich průměrná hodnota.

Stanovení rozdělovacího koeficientu

Rozdělovací koeficient duloxetin-hydrochloridu byl stanoven v systému oktanol-voda (Wells 2002). Obě fáze byly odebrány v poměru 1:1 v/v a vzájemně nasyceny v třepačce ve vodní lázni při 37 °C a poté byly obě fáze odděleny. Deset miligramů léčiva bylo přidáno do směsi 20 ml předem nasycené organické fáze a 20 ml předem nasycené vody a třepe se 10 min. Baňky se poté udržovaly při teplotě 37 °C po dobu 24 hodin za občasného protřepávání. Směs byla následně odstředěna, aby se oddělila vodná a nevodná fáze. Obě fáze byly odděleně spektrofotometricky analyzovány na duloxetin. Rozdělovací koeficient léčiva „K o/w“ byl poté vypočten z poměru koncentrace léčiva v oktanolu a vodné fázi.

Studie interakcí mezi léčivem a polymerem

Fourierova infračervená spektroskopie

Fourierova infračervená spektroskopie (FTIR) byla použita k analýze čistého léčiva DLX, fyzikální směsi DLX a HPMC (15 CR, 100 M a 4 M), jakož i transdermálních náplastí naložených léčivem s využitím metody KBr pelet. Všechny vzorky byly snímány v rozsahu 400 až 4000 cm-1.

Diferenciální skenovací kalorimetrie

Možné interakce mezi léčivem a použitým polymerem byly analyzovány z DSC termogramů čistého léčiva duloxetin hydrochloridu a složení (HPMC + léčivo) získaných pomocí DSC modelu Q20 V24.2 Build 107 (Universal V4.5A TA Instruments). Všechny vzorky byly uzavřeny v hliníkových pánvích s plochým dnem a zahřívány v rozmezí teplot 25 až 300 °C při rychlosti nárůstu 5 °C/min.

Výroba transdermálních náplastí

Transdermální filmy obsahující duloxetin-hydrochlorid byly odlity na skleněném sklíčku metodou odpařování rozpouštědla za použití různých tříd (K 15 M CR, K 4CM, K 100 M) HPMC v přítomnosti a nepřítomnosti změkčovadla. Jako změkčovadlo byl ve všech případech použit PEG 400 (5 %). Tabulka 1 uvádí vzorce a složení pro různé typy formulovaných náplastí. Duloxetin-hydrochlorid (60 mg) byl rozpuštěn ve směsi rozpouštědel voda-methanol (7:3). Léková matrice byla připravena rozpuštěním různých koncentrací (1 % a 1,5 % w/v) HPMC ve stejném systému rozpouštědel. Roztok byl ponechán v neporušeném stavu po dobu 24 h. Poté byl roztok pomocí injekční stříkačky a jehly nalit do skleněného kroužku o průměru 5,0 cm umístěného na povrchu skla. Rozpouštědlo se nechalo 6 h odpařovat v termostatické peci při teplotě 60 °C. Náplasti byly před použitím uchovávány ve vzduchotěsné nádobě za okolních podmínek po dobu 7 dnů.

Tabulka 1 Vzorce a složení připravených transdermálních systémů duloxetinu HCl

Hodnocení transdermálních náplastí

Fyzikální vzhled

Všechny připravené náplasti byly vizuálně kontrolovány z hlediska barvy, průhlednosti, pružnosti a hladkosti.

Tloušťka náplasti

Tloušťka náplastí s léčivem byla měřena pomocí šroubového mikrometru na třech různých místech náplastí. Pro každou náplast naloženou léčivem byly vypočteny průměrné hodnoty a hodnoty směrodatné odchylky těchto tří měření.

Jednotnost hmotnosti

Náplasti byly podrobeny zkoušce změny hmotnosti vážením všech náplastí na digitální váze. Stanovení byla provedena ve třech opakováních pro každý přípravek. Poté byly vypočteny průměrné hodnoty hmotnosti a směrodatné odchylky.

Studie plochosti

Studie plochosti byla provedena za účelem posouzení, zda připravené transdermální náplasti mají hladký povrch a zda se časem nezužují. Z fólie byly vyříznuty tři podélné proužky ve třech různých částech. Byla změřena délka každého proužku a odchylka délky z důvodu nerovnoměrnosti rovinnosti stanovením procenta zúžení, přičemž 0 % zúžení odpovídá 100 % rovinnosti. Procento zúžení bylo získáno jako (l 1 – l 2)/l 1 × 100. Zde l 1 je počáteční délka každého proužku a l 2 je konečná délka každého proužku.

Výdrž při skládání

Tato zkouška byla provedena za účelem ověření účinnosti změkčovadla a pevnosti náplasti připravené pomocí různých polymerů. Výdrž při skládání je definována jako počet záhybů potřebných k přetržení jakékoli polymerní záplaty. Výdrž při skládání byla měřena ručně opakovaným skládáním malého proužku fólie (2 × 2 cm) na stejném místě, dokud se nepřetrhl. Počet přeložení náplasti na stejném místě, aniž by došlo k jejímu porušení/prasknutí, udává hodnotu odolnosti při skládání. Ke zkoušce byly odebrány tři náplasti od každého typu.

Procentní absorpce vlhkosti/absorpce vodní páry

Zkouška procentní absorpce vlhkosti byla provedena za účelem kontroly fyzikální stability a integrity fólií v podmínkách vysoké vlhkosti. Připravené filmy (3,14 cm2) byly jednotlivě přesně zváženy a vystaveny 85 ± 5 % relativní vlhkosti v exsikátoru obsahujícím 100 ml nasyceného roztoku chloridu draselného při pokojové teplotě. Během této doby byly filmy váženy v pravidelných časových intervalech 24, 48 a 72 h. Procento absorpce vlhkosti bylo stanoveno podle následujícího vzorce:

Procentní obsah vlhkosti

Tato zkouška byla rovněž provedena za účelem kontroly integrity filmů v suchých podmínkách. Jednotlivé transdermální filmy (o stanovené ploše) byly uchovávány v exsikátoru obsahujícím roztavený bezvodý chlorid vápenatý při pokojové teplotě. Během této doby byly filmy váženy v pravidelných časových intervalech 24, 48 a 72 h. Procentuální obsah vlhkosti byl stanoven podle následujícího vzorce:

Propustnost vodní páry

Propustnost vodní páry (WVTR) je definována jako množství vlhkosti procházející jednotkou plochy filmu za jednotku času. Jako přenosové cely byly použity skleněné lahvičky o stejném objemu a průměru. Buňky byly řádně omyty a vysušeny v sušárně. Poté byl do každé lahvičky vložen asi 1 g bezvodého taveného chloridu vápenatého a náplast byla upevněna přes okraj lahvičky pomocí lepicí pásky. Tyto lahvičky byly poté zváženy a umístěny do exsikátorů obsahujících nasycený roztok chloridu draselného pro udržení 84% relativní vlhkosti. Tyto buňky byly vyjmuty z exsikátorů a zváženy po 1., 2., 3., 4., 5., 6. a 7. dni. Rychlost přenosu vodních par byla stanovena takto:

$$ W.\ V.\ T. = WL/S $$

Kde W je hmotnost přenesených vodních par, L je tloušťka náplasti a S je plocha vystaveného povrchu ve čtverečních centimetrech.

Povrchové pH

Záplaty byly ponechány ve styku s 0,5 ml dvakrát destilované vody po dobu 1 h ve skleněných zkumavkách a nechaly se nabobtnat. Kombinovaná skleněná elektroda byla přiblížena k povrchu náplasti a po uplynutí doby ekvilibrace v délce 1 min byly odečteny hodnoty pH.

Stanovení obsahu léčivých látek

Z každého typu přípravku byly vyříznuty kousky o velikosti 2 × 2 a vloženy do 100 ml fyziologického roztoku s fosfátovým pufrem o pH 7,4. Kousky byly rozděleny na dvě části. Obsah byl magneticky míchán po dobu 2 h. Poté byl roztok přefiltrován přes Whatmanův filtrační papír (0,45 μ) a vhodně naředěn fyziologickým roztokem fosfátového pufru pH 7,4. Roztok byl následně rozpuštěn. Roztok byl poté analyzován na absorbanci při vlnové délce 289 nm za použití placebo náplasti jako slepého vzorku. Z hodnot absorbance byl stanoven obsah léčiva.

In vitro uvolňování léčiva

Pro in vitro charakterizaci transdermálních formulací byla použita Franzova difuzní cela. Jedná se o spolehlivou metodu pro předpověď transportu léčiv přes kůži z topických přípravků. Receptorový prostor difuzní cely byl naplněn 30,0 ml fyziologického roztoku s fosfátovým pufrem (pH 7,4) a pomocí syntetické celofánové membrány byly provedeny studie uvolňování léčiva in vitro. Připravené přípravky byly naneseny na membránu v donorovém prostoru a rovnoměrně se rozprostřely na celofánovou membránu. Sestava byla neustále udržována při teplotě 37,0 ± 2,0 °C při 50 otáčkách za minutu. Vzorky (alikvoty o objemu 1,0 ml) byly poté odebírány ve vhodných časových intervalech (0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 6, 12 a 24 h) a doplňovány takovým množstvím média, aby se udržel objem receptorové fáze na 30 ml. Vzorky byly analyzovány spektrofotometricky při vlnové délce 289 nm.

Studie permeace léčiv/ex vivo

Studie permeace léčiv byly provedeny pomocí kůže samců potkanů Wistar. Potkani byli usmrceni dislokací páteře. Vzorky kůže byly rozříznuty, odstraněny a promyty fyziologickým roztokem. Přiléhající tuk a pojivová tkáň byly odstraněny tupými kleštěmi. Kůže byla uchovávána v normálním fyziologickém roztoku po dobu 6 h. Chlupy z kůže potkanů byly pečlivě oholeny, aby nedošlo k perifernímu poškození. Receptorový prostor Franzovy difuzní cely byl naplněn 30 ml fyziologického roztoku s fosfátovým pufrem (pH 7,4). Připravené přípravky byly aplikovány na kůži potkana v donorovém prostoru. Teplota sestavy byla trvale udržována na 37 ± 2 °C a rychlost míchání byla kontrolována na 50 otáček za minutu. Vzorky (alikvoty o objemu 5 ml) byly odebírány ve vhodných časových intervalech (0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 a 24 h) a nahrazovány stejným množstvím média, aby se udržel objem receptorové fáze na 30 ml. Vzorky byly analyzovány spektrofotometricky při λ max 289 nm.

Studie kožní dráždivosti

Etické povolení k zacházení s pokusnými zvířaty bylo získáno od Institutional Animal Ethical Committee (IAEC), Panjab University, Chandigarh, a studie byly provedeny podle schváleného protokolu.

Potkani albino Wistar byli umístěni v klecích, s volným přebytkem standardní laboratorní stravy a vody. Hřbetní břišní kůže potkanů byla před 24 hodinami provádění studie pečlivě oholena, aby nedošlo k poškození periferie. Transdermální náplast byla aplikována na nahou kůži a překryta necitlivou mikroporézní páskou. Jako standardní dráždidlo kůže byl použit 0,8% v/v vodný roztok formalinu. Zvířatům byla každý den aplikována nová náplast, a to až po dobu 7 dnů. Po 7 dnech byl přípravek odstraněn; bylo zaznamenáno skóre erytému a porovnáno se standardem. Skóre erytému bylo odečteno a zaznamenáno podle Draizeho skórovací metody (Draize et al. 1944) jako skóre 0 pro žádný erytém, skóre 1 pro velmi mírný erytém (světle růžový), skóre 2 pro dobře ohraničený erytém (tmavě růžový), skóre 3 pro střední až silný erytém (světle červený) a skóre 4 pro silný erytém (tmavě červený).

Analýza dat

Pro n-tý vzorek je V s objem odebraného vzorku, V t je celkový objem receptorového média, C c je korigovaná koncentrace, C u je nekorigovaná koncentrace n-tého vzorku a C i je nekorigovaná koncentrace. Dále byla korigovaná koncentrace použita k výpočtu hodnot množství uvolněného léčiva a procenta uvolněného léčiva v každém okamžiku odběru vzorku spolu s rychlostí uvolňování léčiva.

Koeficient propustnosti je rychlost průchodu léčiva membránou/koží v μg/cm2/h. Koeficient propustnosti byl vypočten ze sklonu grafu závislosti procenta transportovaného léčiva na čase jako P = sklon × V d/S

Tady V d je objem donorového roztoku v mililitrech a S je plocha povrchu tkáně v centimetrech čtverečních.

Průtok (hodnota J) je definován jako množství materiálu protékajícího jednotkovým průřezem bariéry za jednotku času. Vypočítá se podle: