Doxycyklin působí protizánětlivě a inhibuje stafylokokový exotoxin-Indukované cytokiny a chemokiny

Toxin 1 stafylokokového syndromu toxického šoku (TSST-1) a strukturně příbuzné exotoxiny jsou bakteriální exotoxiny, které se přímo vážou na molekuly hlavního histokompatibilního komplexu II. třídy na antigen prezentujících buňkách (1, 5, 8, 18, 23) a aktivují T buňky exprimující specifické Vβ elementy (7). Tyto toxiny se nazývají superantigeny, protože mají schopnost polyklonálně stimulovat velké populace T buněk (1, 4, 7, 14). Stafylokokové exotoxiny (SE) jsou tedy silnými aktivátory imunitního systému a u lidí způsobují řadu onemocnění, včetně otravy potravinami, toxického šoku a autoimunitních onemocnění (1, 2, 6, 12, 14, 22). Jejich interakce s buňkami imunitního systému vede k masivní produkci prozánětlivých cytokinů a chemokinů (1, 4, 15, 17). Cytokiny tumor nekrotizující faktor alfa (TNF-α), interleukin-1 (IL-1) a interferon gama (IFN-γ) jsou klíčovými mediátory toxického šoku vyvolaného superantigenem (1, 21). TNF-α i IL-1 mají silnou imunostimulační aktivitu a působí synergicky s IFN-γ, čímž posilují imunitní reakce a podporují poškození tkání (16). V důsledku toho jsou tyto cytokiny ve vysokých koncentracích patogenní in vivo a jsou zodpovědné za horečku a toxický šok vyvolaný SE (13, 14, 18, 19).

Doxycyklin je širokospektré antibiotikum široce používané u infekcí způsobených gramnegativními i grampozitivními mikroorganismy. Působí jako bakteriostatikum a je vysoce účinný proti mnoha mikroorganismům, včetně Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Bacillus anthracis a Yersinia pestis. Doxycyklin patří do skupiny tetracyklinových antibiotik, u jejichž členů byly prokázány další biologické účinky nezávislé na jejich antimikrobiálních účincích (10). Doxycyklin inhibuje matrixovou metaloproteinázu 8 (MMP-8) a MMP-9 v lidských endoteliálních buňkách (11). Doxycyklin také snižuje degradaci elastinu a snižuje aktivitu MMP v modelu aneuryzmatického onemocnění (3). Nedávno bylo prokázáno, že doxycyklin inhibuje produkci IL-1β v lipopolysacharidem ošetřených rohovkových epiteliálních kulturách v míře srovnatelné s mírou dosaženou kortikosteroidy (25). In vivo doxycyklin chránil myši před smrtelnou endotoxemií snížením sekrece cytokinů a nitrátů v krvi (20). Tato studie byla provedena za účelem stanovení modulačního účinku doxycyklinu na stafylokokovou superantigenem indukovanou aktivaci T-buněk a produkci cytokinů z lidských mononukleárních buněk periferní krve (PBMC).

Lidské PBMC byly izolovány centrifugací na hustotním gradientu Ficoll-Hypaque z heparinizované krve od normálních lidských dárců. PBMC (106/ml) byly kultivovány při 37 °C na 24jamkových destičkách obsahujících médium RPMI 1640 a 10% tepelně inaktivované fetální hovězí sérum. Buňky byly inkubovány se SEB (200 ng/ml) nebo TSST-1 (200 ng/ml) po dobu 16 hodin a supernatanty byly odebrány a analyzovány na IL-1β, TNF-α, IL-6, IFN-γ, MCP-1, MIP-1α a MIP-1β. Cytokiny a chemokiny byly měřeny pomocí enzymatického imunosorbčního testu s protilátkami specifickými pro cytokiny nebo chemokiny v souladu s pokyny výrobce (15, 17). Jako standardy pro kalibraci na každé destičce byly použity lidské rekombinantní cytokiny a chemokiny (20 až 1 000 pg/ml). Detekční limit každého testu byl 20 pg/ml. Údaje o cytokinech a chemokinech byly vyjádřeny jako průměrná hodnota ± směrodatná odchylka (SD) duplicitních vzorků. Doxycyklin, pokud byl přítomen, byl přidán současně se stimulačním činidlem. Cytotoxicita byla měřena uvolňováním laktátdehydrogenázy (LDH) z cytosolu do supernatantu kultury. LDH byla kvantifikována pomocí kolorimetrické soupravy pro stanovení cytotoxicity (Boehringer Mannheim) podle pokynů výrobce. Maximální množství uvolnitelné LDH (100 %) bylo získáno lýzou buněk 1% Tritonem X-100. Proliferace T-buněk byla testována s PBMC (105/jamka), které byly naneseny ve třech opakováních se SEB nebo TSST-1 (200 ng/ml), s doxycyklinem nebo bez něj, po dobu 48 h při 37 °C v 96jamkových mikrotitračních destičkách. Během posledních 5 h kultivace byly buňky pulzovány 1 μCi thymidinu (New England Nuclear, Boston, Mass.) na jamku, jak bylo popsáno dříve (15). Buňky byly sbírány na filtry ze skleněných vláken a inkorporovaný thymidin byl měřen kapalinovou scintilací. Všechna data byla analyzována na významné rozdíly pomocí Studentova t-testu v programu Stata (Stata Corp., College Station, Tex.). Rozdíly mezi skupinami léčenými doxycyklinem a neléčenými kontrolními skupinami byly považovány za významné, pokud P bylo <0,05.

Na základě zprávy, že doxycyklin blokoval IL-1 indukovaný lipopolysacharidem v epiteliálních buňkách a zabránil letální endotoxemii in vivo (20, 25), jsme testovali hypotézu, že toto antibiotikum může mít přímý vliv na cytokiny indukované SE. Jak ukazuje obr. 1, doxycyklin v závislosti na dávce inhiboval produkci cytokinů IL-1β, IL-6, TNF-α a IFN-γ a chemokinů MCP-1, MIP-1α a MIP-1β PBMC inkubovanými se SEB. Podobné snížení cytokinů a chemokinů v závislosti na dávce doxycyklinu bylo pozorováno také u PBMC stimulovaných TSST-1 (údaje nejsou uvedeny). Inhibiční účinek doxycyklinu na cytokiny a chemokiny zprostředkované SEB nebo TSST-1 získaný s PBMC od sedmi normálních dárců je shrnut na obr. 2. Produkce MCP-1 a IFN-γ byla zcela blokována 50 μM doxycyklinu. Tato koncentrace doxycyklinu snížila IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP-1α a MIP-1β na 15 až 22 %, 37 až 41 %, 21 až 25 %, 10 až 15 %, respektive 59 až 61 % hodnoty u neošetřených, SEB nebo TSST stimulovaných buněk. TNF-β, pokud byl přítomen, byl rovněž inhibován na 25 % oproti neošetřeným buňkám stimulovaným SEB. Doxycyklin nebyl při této koncentraci pro PBMC cytotoxický, což bylo měřeno vyloučením trypanové modři a absencí uvolňování laktátdehydrogenázy z ošetřených buněk. Úplná inhibice těchto cytokinů a chemokinů byla pozorována při vysokých dávkách doxycyklinu (>0,1 mM). Podobná inhibice doxycyklinu v závislosti na dávce byla pozorována i při nižších koncentracích SEB (1 a 10 ng/ml) (údaje nejsou uvedeny).

Protože superantigeny také způsobují proliferaci T-buněk, byl zkoumán účinek doxycyklinu na proliferaci T-buněk indukovanou SE. Obrázek 3 ukazuje, že doxycyklin inhiboval proliferaci T-buněk stimulovaných SEB a TSST-1 v závislosti na dávce, přičemž při 0,05 mM dosáhl 98% inhibice.

Tato studie prokázala, že doxycyklin účinně inhibuje superantigenem zprostředkovanou produkci cytokinů a chemokinů lidskými PBMC in vitro. Proliferace T-buněk indukovaná stafylokokovými superantigeny byla rovněž zcela potlačena. Snížení regulace prozánětlivých cytokinů a chemokinů doxycyklinem u PBMC stimulovaných SEB a TSST-1 naznačuje, že doxycyklin může ovlivnit patofyziologii toxického šoku. Tato zjištění rozšiřují pozorování jiných badatelů o imunomodulačních účincích doxycyklinu vedle jeho antimikrobiálních aktivit.

Na protizánětlivých účincích doxycyklinu se může podílet více molekulárních mechanismů, jak transkripčních, tak posttranskripčních (11, 26). Potlačení prozánětlivých cytokinů může zahrnovat downregulaci dráhy PKC doxycyklinem, jak naznačuje studie jeho účinků na tvorbu granulomů (26). Uváděná inhibiční dávka doxycyklinu (10 až 15 μM), která snižuje kolagenázu, želatinázu a další metaloproteinázy in vitro (10, 11), je srovnatelná s dávkou použitou v této studii a je několikanásobně vyšší než dávka pozorovaná v lidském séru po perorálním podávání 200 mg denně (10, 24). Klinické studie však ukazují, že tato dávka byla dostatečná pro snížení aktivity kolagenázy a želatinázy v extraktech lidské osteoartritické chrupavky ex vivo (24). Bylo prokázáno, že subantimikrobiální dávka doxycyklinu (20 mg dvakrát denně) inhibuje aktivitu kolagenázy v dásňové tekutině (9). Kromě toho studie in vivo experimentální endotoxémie také zjistily, že doxycyklin a další tetracykliny jsou účinné při snižování regulace zánětlivých cytokinů a prevenci šoku (20).

Závěrem lze říci, že zde prezentované výsledky naznačují, že doxycyklin snižuje regulaci prozánětlivých cytokinů a chemokinů, což naznačuje jeho potenciální užitečnost pro léčbu toxického šoku vyvolaného superantigenem. V klinickém prostředí, kdy je hostitel vystaven působení více biologických činitelů, včetně bakterií i bakteriálních exotoxinů, nabízí použití doxycyklinu další výhodu spočívající v tom, že poskytuje jak antimikrobiální, tak protizánětlivé účinky.