ARTIGOO ORIGINAL / ORIGINAL ARTICLE

DIAGNÓZA DEFICIENCE ALFA-1-ANTITRYPSINU POMOCÍ ANALÝZY DNA DĚTÍ S OCHORENÍM JÁTER*

Adriana Maria Alves De TOMMASO1, Cláudio Lúcio ROSSI2, Cecília Amélia Fazzio ESCANHOELA3, Heliane Guerra SERRA4, Carmen Sílvia BERTUZZO5 a Gabriel HESSEL6

ABSTRACT ¾ Background – Alpha-1-antitrypsin deficiency is a genetic disorder which is transmitted in a co-dominant, autosomal form. Deficit alfa-1-antitrypsinu postihuje především plíce a játra, což v druhém případě vede k novorozenecké cholestáze, chronické hepatitidě nebo cirhóze. Přesnou diagnózu deficitu alfa-1-antitrypsinu lze stanovit biochemickou nebo molekulární analýzou. Cíl – Cílem této studie bylo použít analýzu DNA ke zkoumání přítomnosti deficitu alfa-1-antitrypsinu u 12 dětí, u nichž bylo podezření na tento deficit a které vykazovaly laboratorní a klinické charakteristiky onemocnění. Pacienti a metody – Bylo zkoumáno 12 pacientů ve věku od 3 měsíců do 19 let, kteří měli sérové hladiny alfa-1-antitrypsinu nižší než normální a/nebo měli jaterní onemocnění neurčené etiologie. U těchto 12 dětí byly vyšetřeny mutantní alely S a Z genu pro alfa-1-antitrypsin. Organizace genu pro alfa-1-antitrypsin byla analyzována pomocí amplifikace genomu polymerázovou řetězovou reakcí a štěpením restrikčními enzymy Xmnl (alela S) a Taq 1 (alela Z). Výsledky – Sedm z 12 pacientů mělo chronické jaterní onemocnění neurčené etiologie a dalších pět pacientů mělo nízké sérové hladiny alfa-1-antitrypsinu a také diagnózu novorozenecké cholestázy a/nebo chronického jaterního onemocnění neurčené etiologie. Pět z 12 pacientů bylo homozygotních pro alelu Z (ZZ) a dva měli alelu S s další alelou (*S) odlišnou od Z. Závěr – Tyto výsledky ukazují, že nedostatek alfa-1-antitrypsinu je poměrně častý u dětí s chronickým jaterním onemocněním neurčité etiologie a/nebo nízkou hladinou alfa-1-antitrypsinu (41,6 %). Správná diagnóza je důležitá pro účinné klinické sledování a pro genetické poradenství.

HLAVY ¾ Deficit alfa-1-antitrypsinu. Molekulární diagnostika. Jaterní biopsie.

ÚVOD

Alfa-1-antitrypsin (A1AT) je 52 kDa glykoprotein produkovaný především hepatocyty, které denně uvolňují 2 g tohoto proteinu do krevního oběhu(36). Hlavní funkcí A1AT je inhibovat působení neutrofilní elastázy, serinové proteázy, která hydrolyzuje elastinová vlákna v plicích(38). Mutace v genu kódujícím A1AT produkují protein bez inhibiční schopnosti a mohou vést k akumulaci A1AT v inkluzních tělískách v hepatocytech, a tím ke snížení normální sérové hladiny tohoto proteinu(4). Tento nedostatek se projevuje jako plicní emfyzém, chronická bronchitida nebo bronchiektázie(9). Akumulace mutantního A1AT v hepatocytech může také vést k novorozenecké cholestáze, chronické hepatopatii nebo cirhóze(33, 34).

Gen A1AT je vysoce polymorfní, ko-dominantní a nachází se na delším raménku chromozomu 14 (14q 31-32.3)(20, 29). Pro tento gen bylo popsáno 75 alel (označovaných A-Z podle jejich izoelektrických bodů) na základě izoelektrické fokusace séra mezi pH 4 (anoda) a pH 5 (katoda) v polyakrylamidových gelech. Běžné varianty migrují do středu gelu, a proto patří do rodiny M („middle“). Deficitní varianta, kterou původně popsali LAURELL a ERIKSSON v roce 1963(21) , migruje směrem ke katodě a označuje se Z. Další varianta, která se v gelu pohybuje pomalu, se označuje S(5). Tento polymorfní „lokus“ je obecně znám jako systém Pi (inhibitor proteázy). Většina variant produkuje A1AT v normálním množství a kvalitě(7, 8, 25). Některé alely, jako jsou varianty S a Z, jsou však spojeny s deficitním stavem, který dosahuje polymorfních frekvencí jako u kavkazské populace, a byly zaznamenány případy nulové alely, u níž produkce proteinu zcela chybí(10).

Alela S je výsledkem záměny adeninu za thiamin v exonu III genu, což vede k záměně kyseliny glutamové na pozici 264 za valin a následnému vzniku nestabilní struktury proteinu(10, 11, 19). Alela Z je výsledkem záměny guaninu v poloze 342 za adenin v exonu V genu a vede ke vzniku proteinu, který se shromažďuje na vnitřním drsném povrchu endoplazmatického retikula hepatocytů(6). Diagnóza deficientního stavu se obvykle stanoví po kvantifikaci sérových hladin proteinu spolu s elektroforetickým profilem po izoelektrické fokusaci(23, 37). Přesnější diagnóza vyžaduje genovou analýzu pomocí technik založených na DNA(12, 14, 26).

Cílem této studie bylo identifikovat nositele alel S a Z u pacientů s podezřením na tento deficit, kteří vykazovali laboratorní a klinické charakteristiky tohoto onemocnění.

PATENTI A METODY

Pacienti

V období od února 1988 do srpna 1997 bylo na Pediatrické gastroenterologické oddělení Státní univerzity v Campinas, Campinas, SP, Brazílie, odesláno velké množství pacientů za účelem vyšetření jaterních onemocnění. Z tohoto počtu pouze 12 pacientů nevykazovalo žádnou definitivní diagnózu (negativní výsledky na virovou hepatitidu, autoimunitní hepatitidu a Wilsonovu chorobu). Tito pacienti byli podrobeni molekulární analýze A1AT.

Metody

1 ¾ Protokol studie

2 – Biopsie jater

Perkutánní jaterní biopsie byly získány podle popisu MOWAT(24) za použití lokální anestezie u pacientů nalačno po dobu nejméně 4 hodin, s venoklýzou a normální protrombinovou aktivitou. Získaný fragment byl ihned uložen do 10% formalínu a poté zpracován a obarven hematoxylin-eosinem, Massonovým trichromem, pruskou modří a impregnací stříbrem retikulárních vláken. Speciální barvení bylo získáno pomocí PAS (periodická kyselina Schiffova) s následným ošetřením diastázou. Přetrvávání cytoplazmatických granulí eozinofilního vzhledu i po použití diastázy bylo považováno za pozitivní pro deficit A1AT.

3 – Molekulární analýza

Za účelem vyšetření mutantních alel S a Z A1AT byla provedena extrakce DNA z leukocytů periferní krve podle metody popsané WOODHEADEM a kol(39).

VÝSLEDKY

Pět z 12 studovaných dětí bylo homozygoty Z (ZZ), zatímco dvě děti měly alelu S spolu s další alelou, která nebyla Z (*S). V tabulce 1 je uveden věk pacienta v době odběru krve a indikace, podle které bylo rozhodnuto o následné analýze. Tři z pacientů měli novorozeneckou cholestázu jako počáteční projev chronické hepatopatie.

Tabulka 2 uvádí sérové hladiny ALT, AP, gGT, A1AT a také výsledky molekulárního vyšetření a jaterní biopsie.

Pět pacientů s genotypem ZZ mělo snížené sérové hladiny A1AT a jaterní biopsie prokázala cirhózu (jeden), neonatální hepatitidu (dva), nedostatečnost interlobulárních žlučových cest (jeden) a chronickou hepatitidu (jeden). V posledním případě (FSP) byla v periportálních hepatocytech po barvení HE patrná cytoplazmatická granula eozinofilního vzhledu, která byla posteriorně potvrzena pozitivitou PAS a diastázovou rezistencí (obr. 1). U dvou pacientů s novorozeneckou cholestázou (EKBA a RHBP) byla jaterní biopsie provedena ve věku 10 týdnů, resp. 13 týdnů a prokázala eozinofilní PAS pozitivní globule rezistentní na diastázu.

Obrázky 2 a 3 ukazují výsledky amplifikace a štěpení alel S a Z v tomto pořadí.

DISKUSE

Deficit alfa-1-antitrypsinu je jednou z nejčastějších genetických poruch, která vede k onemocnění jater u dětí, a je to nejčastější genetické onemocnění vyžadující transplantaci jater(17, 28). Deficit A1AT postihuje 1 z 1600-2000 novorozenců v Severní Americe a severní Evropě(28, 31), ale pouze u 10-15 % populace s tímto deficitem dochází k rozvoji jaterních onemocnění(32, 33). Podle studie publikované SVEGER v roce 1988(33) se v novorozeneckém období u 11 % pacientů s fenotypem PIZZ vyvine ikterická hepatitida. V této studii měli tři pacienti s diagnostikovaným deficitem A1AT neonatální cholestázu a u dvou z nich byla před stanovením definitivní diagnózy deficitu cholestáza považována za idiopatickou. Pět až 10 % případů idiopatické neonatální hepatitidy uváděných v literatuře je způsobeno deficitem A1AT(3).

U pěti studovaných pacientů s tímto deficitem byly sérové hladiny A1AT pod dolní hranicí normy. Toto vyšetření však diagnózu onemocnění absolutně nepotvrdilo. Vzhledem k tomu, že A1AT je protein akutní zánětlivé fáze, jeho syntéza se zvyšuje při zánětlivých/infekčních stavech, neoplaziích, těhotenství a při léčbě estrogeny a kortikosteroidy(16, 22). Ke snížení sérových hladin A1AT dochází při syndromu respirační úzkosti novorozenců, v terminální fázi jaterního selhání, při cystické fibróze a v situacích, kdy dochází k velkým ztrátám bílkovin(15). Sérové hladiny u SZ genotypů, které by teoreticky mohly vést k jaterním onemocněním, jsou obvykle normální.

Při přítomnosti novorozenecké cholestázy je zásadně nutná diferenciální diagnostika s extrahepatální biliární atrézií. Klinická anamnéza umožňuje adekvátní diagnózu v 83 % případů(1) a ke zvýšení přesnosti diagnózy je nutné provést specifická vyšetření. Mezi těmito vyšetřeními má zásadní význam jaterní biopsie. Histopatologické změny pozorované v jaterní biopsii pacientů s deficitem A1AT mohou být stejné jako změny pozorované u idiopatické neonatální hepatitidy nebo v případech extrahepatální biliární atrézie(24). Přítomnost převážně periportálních, intrahepatocystických globulí, které jsou po rozkladu diastázou silně PAS pozitivní, je užitečným ukazatelem deficitu A1AT(13, 18, 27). Tyto globule je však obtížné identifikovat před 12. týdnem po narození(35). V této studii měl pacient EKBA globule s výše uvedenými charakteristikami v jaterní tkáni ve věku 10 týdnů. U pacienta JCI (ve věku 13 týdnů) nebyly žádné takové globule pozorovány. Tyto výsledky naznačují, že přítomnost globulí by měla být vyšetřena pomocí speciálního barvení v jaterních fragmentech získaných před dosažením věku 12 týdnů, i když negativní výsledek nevylučuje možnost deficitu A1AT. Biochemická analýza nebyla v této studii použita, protože bylo možné provést analýzu DNA, která je přesnější.

Deficit A1AT je poměrně častý u dětí, které mají jaterní onemocnění neurčité etiologie. Tato diagnóza je podhodnocena, pravděpodobně proto, že se používají nepřesné diagnostické metody. Molekulární analýza poskytuje přesnější diagnózu a může být užitečná i pro genetické poradenství pacientů s jaterním onemocněním neznámé etiologie.

De Tommaso AMA, Rossi CL, Escanhoela CAF, Serra HG, Bertuzzo CS, Hessel G. Diagnóstico da deficiência de alfa-1-antitripsina por estudo molecular em crianças com doença hepática. Arq Gastroenterol 2001;38(1):63-68.

RESUMO – Racional – A deficiência de alfa-1-antitripsina é uma doença genética transmitida de forma autossômica co-dominante. As manifestestações clínicas principais incluem acometimento pulmonar e hepático. Este último, apresenta-se como colestase neonatal, hepatite crônica ou cirrose. Definitivní diagnóza se stanoví biochemickou analýzou alfa-1-antitrypsinu nebo molekulární analýzou. Objetivo – Investigar, em um grupo de 12 crianças com suspeita de deficiência de alfa-1-antitripsina, a presença efetiva da deficiência através da análise de DNA, para um diagnóstico definitivo, bem como a associação entre os deficientes de alfa-1-antitripsina com as características clínicas e laboratoriais encontradas. Kazuistika a metody – Mutantní alely S a Z genu pro alfa-1-antitrypsin byly zkoumány u 12 pacientů ve věku od 3 měsíců do 19 let, odeslaní dětskou gastroenterologickou ambulancí Universidade Estadual de Campinas, SP, Brazílie, pro hladinu alfa-1-antitrypsinu v séru nižší než normální a/nebo jaterní onemocnění bez definované etiologie. Analýza DNA byla provedena pomocí modifikované metody amplifikace genu polymerázovou řetězovou reakcí, která vytváří restrikční místa pro enzymy Xmnl (alela S) a Taq l (alela Z). Výsledky – Z 12 odeslaných pacientů mělo 7 chronické onemocnění jater bez definované etiologie a dalších 5 mělo nízké sérové dávky alfa-1-antitrypsinu doprovázené diagnózou novorozenecké cholestázy a/nebo chronického onemocnění jater neznámé etiologie. V této skupině 12 pacientů bylo pozorováno pět homozygotů Z (ZZ) a dva pacienti nesli alelu S doprovázenou další alelou, odlišnou od Z (*S). Závěr – Tyto výsledky ukazují, že deficit A1AT je poměrně častou etiologií u dětí s chronickým jaterním onemocněním bez definované etiologie a/nebo nízkou sérovou dávkou A1AT (41,6 %). Význam jisté diagnózy deficitu je opodstatněný nejen pro klinické sledování pacienta, ale také z hlediska genetického poradenství.

DESKRITORY ¾ Deficit alfa-1-antitrypsinu. Molekulární diagnostika. Biopsie jater.

1. Alagille D. Cholestáza v prvních třech měsících života. Prog Liver Dis 1979;6:471-85.

2. Andresen BS, Knudsen I, Jensen PKA, Gregersen N. Two novel nonradioactive polymerase chain reaction-based assays of dried blood spots, genomic DNA, or whole cells for fast, reliable detection of Z and S mutations in the Alpha-1-antitrypsin gene. Clin Chem 1992;38:2100-7.

5. Brantly M, Nukiwa T, Crystal RG. Molekulární podstata deficitu alfa-1-antitrypsinu. Am J Med 1988;84:13-31.

6. Carlson JA, Rogers RB, Sifers R. Acumulation of PiZ alpha 1-antitrypsin causes liver damage in transgenic mice. J Clin Invest 1989;83:1183-90.

8. Cox DW, Woo SL, Mansfield T. Restrikční fragmenty DNA spojené s alfa 1-antitrypsinem naznačují jediný původ pro alelu nedostatku PI Z. Nature 1985;316:79-81.

9. Crystal RG, Brantly ML, Hubbard RC, Curiel DT, States DJ, Holmes MD. Gen pro alfa 1-antitrypsin a jeho mutace. Klinické důsledky a strategie terapie. Chest 1989;95:196-208.

11. Curiel D, Brantly M, Curiel E, Crystal RG. Deficit alfa-1-antitrypsinu způsobený genem alfa-1-antitrypsinu Nullmattawa. Vložená mutace způsobující neschopnost genu pro alfa-1-antitrypsin produkovat alfa-1-antitrypsin. J Clin Invest 1989;83:1144-52.

12. Dermer SJ, Johnson EM. Rychlá analýza DNA při nedostatku alfa-1-antitrypsinu: použití zdokonalené metody amplifikace sekvence mutovaného genu. Lab Invest 1988;59:403-8.

13. Deutsch J, Becker H, Auböck L. Histopatologické rysy jaterního onemocnění při deficitu alfa 1-antitrypsinu. Acta Paediatr 1994;393 Suppl:8-12.

14. Dubel JR, Finwick R, Hejtmancik JF. Denaturační gradientová gelová elektroforéza genu pro alfa 1-antitrypsin: použití v prenatální diagnostice. Am J Med Genet 1991;41:39-43.

15. Evans HE, Levi M, Mandl I. Sérové koncentrace inhibitorů enzymů u syndromu respirační tísně. Am Rev Resp Dis 1970;101:359-63.

18. Ishak KG. Hepatální morfologie u dědičných metabolických onemocnění. Sem Liver Dis 1986;6:246-58.

20. Lai EC, Kao FT, Law ML, Woo SL. Přiřazení genu pro alfa 1-antitrypsin a genu příbuzného sekvenci k lidskému chromozomu 14 pomocí molekulární hybridizace. Am J Hum Genet 1983;35:385-92.

21. Laurell CB, Eriksson S. The electrophoretic alpha-1-globulin pattern of serum in alpha-1-antitrypsin deficiency. Scand J Clin Lab Invest 1963;15:132-40.

22. Laurell CB, Kullander S, Thorell J. Effect of administration of a combined strogen-progestin contraceptive on the level of individual plasma proteins. Scand J Clin Lab Invest 1968;21:337-43.

23. Massi G, Chiarelli C. Alfa 1-antitrypsin: molekulární a Pi systém. Acta Paediatr 1994;393 Suppl:1-4.

26. Okayama H, Curiel DT, Brantly ML, Holmes MD, Crystal RG. Rychlá neradioaktivní detekce mutací v lidském genomu pomocí alelově specifické amplifikace. J Lab Clin Med 1989;114:105-13.

28. Perlmutter DH. Klinické projevy nedostatku alfa 1-antitrypsinu. Gastroenterol Clin North Am 1995;24:27-43.

30. Serra HG. Identificação molecular dos alelos S e Z do gene da alfa-1-antitripsina em um grupo de pacientes portadores de doença pulmonar crônica . Campinas, SP: Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas; 1998.

31. Silverman EK, Miletich JP, Pierce JA, Sherman LA, Endicott SK, Broze GJ, Campbell EJ. Alpha-1-antitrypsin deficiency. Vysoká prevalence v oblasti St. Louis zjištěná přímým populačním screeningem. Am Rev Respir Dis 1989;140:961-6.

32. Sveger T. Onemocnění jater při deficitu alfa 1-antitrypsinu zjištěné screeningem u 200 000 kojenců. N Engl J Med 1976;294:1316-21.

33. Sveger T. The natural history of liver disease in alpha 1-antitrypsin deficient children. Acta Paediatr Scand 1988;77:847-51.

35. Talbot IC, Mowat AP. Onemocnění jater v kojeneckém věku. Histologické rysy a vztah k fenotypu alfa 1-antitrypsinu. J Clin Pathol 1975;28:559-63.

36. Travis J, Salvesen GS. Human plasma proteinase inhibitors. Annu Rev Biochem 1983;52:655-709.

37. Van Steenbergen W. Alpha 1-antitrypsin deficiency: an overview. Acta Clin Belg 1993;48(3):171-89.

38. Wewers MD, Casolaro MA, Sellers SE, Swayze SC, McPhaul KM, Wittes JT, Crystal RG. Nedostatek substituční terapie spojený s rozedmou plic. N Engl J Med 1987;316:1055-62.

Recebido em 3/11/1999.
Aprovado em 6/11/2000.

* Studie provedená katedrami pediatrie, lékařské genetiky, anatomické patologie a klinické patologie Fakulty lékařských věd (FCM), State University of Campinas – UNICAMP, Campinas, SP, Brazílie.

1 Postgraduální student. Katedra pediatrie, FCM/UNICAMP.

2 Odborný asistent. Oddělení klinické patologie, FCM/UNICAMP.

3 Odborný asistent. Oddělení anatomické patologie, FCM/UNICAMP.

4 Doktorát z genetiky (Biologický ústav), UNICAMP.

5 Odborný asistent. Ústav lékařské genetiky, FCM/UNICAMP.

6 Odborný asistent. Katedra pediatrie, FCM/UNICAMP.