Clostridium botulinum: Vlastnosti, patogeneze a laboratorní diagnostika

Clostridium botulinum je grampozitivní, endosporulující bacil, který díky přítomnosti spor na subterminálním konci připomíná vzhled tenisové rakety.

Tvoří extrémně smrtelný neurotoxin zvaný botulotoxin a způsobuje botulismus, vzácné život ohrožující neuroparalytické onemocnění. Botulismus se projevuje různými klinickými syndromy od otravy potravinami, infekce ran až po kojenecký botulismus.

Termín botulinum byl odvozen z latinského slova „botulus“, což znamená klobása; protože špatně uvařené klobásy byly dříve spojovány s otravou potravinami. Botulinum produkují i jiné klostridie, například C. butyricum, C. baratti a C. argentinense.

Letální dávka botulotoxinu pro člověka je 2 μg nebo méně, takže C. botulinum má potenciál být použita jako biologická zbraň. CDC ji zařadila do „kategorie A agens“ spolu s Bacillus anthracis, Yersinia pestis atd.

Patogeneze

Přenos:

V přírodě je všudypřítomný, široce rozšířený jako saprofyt v půdě, zvířecím trusu, zelenině a mořském bahně. Domácí konzervy, koření a rybí výrobky jsou nejčastějšími zdroji infekce C. botulinum. Požití kontaminovaného medu je hlavní příčinou kojeneckého botulismu.

Nedostatečná teplota vaření a následné balení v anaerobních podmínkách usnadňuje klíčení spor a syntézu neurotoxinů.

Mechanismus účinku botulotoxinu (BoNT)

Clostridium botulinum je neinvazivní. Jeho patogeneze je způsobena produkcí silného neurotoxinu „botulotoxinu“ (BoNT), pravděpodobně nejtoxičtější známé látky, která je pro člověka smrtelná. Vyvolává ochablou paralýzu. Existuje 7 sérologických typů botulinum neurotoxinu označovaných jako typy A, B, C , D, E, F a G. Lidský botulismus způsobují především typy A, B, E a F (vzácně).

C. Botulotoxin je zařazen do kategorie potenciálních bioteroristických látek, ale botox se používá k vyhlazování obličejových vrásek.

Po vstupu (buď požití, vdechnutí nebo vytvoření v ráně) je botulotoxin transportován krví do periferních cholinergních nervových zakončení. Nejčastějšími místy nervových terminálů jsou nervosvalové spoje, postgangliová parasympatická nervová zakončení a periferní ganglia. Nepůsobí na CNS.

V normálním stavu: Při stimulaci periferních a kraniálních nervů se acetylcholin normálně uvolňuje z vezikul na nervové straně motorického zakončení. Acetylcholin se pak váže na specifické receptory na svalu a vyvolává kontrakci.

Botulotoxin působí tak, že se váže na synaptické vezikuly cholinergních nervů, čímž zabraňuje uvolňování acetylcholinu (Ach) na periferních nervových zakončeních, včetně nervosvalových spojů. To má za následek nedostatek podnětů pro svalová vlákna, nevratnou relaxaci svalů a ochablou paralýzu.

Jelikož botulotoxin způsobuje ochablou paralýzu, může být terapeuticky použit k léčbě křečových stavů, jako je strabismus (špatné postavení očí), blefarospasmus (nekontrolovatelné mrkání) a myoklonus.

Klinické projevy

Projevy botulismu jsou způsobeny sníženým obsahem acetylcholinu v terminálech kraniálních nervů a parasympatiku. Mezi nejčastější příznaky patří:

1. Diplopie (dvojité vidění) nebo rozmazané vidění
2. Dysfagie (potíže s polykáním)
3. Dysartrie (potíže s řečí) nebo nezřetelná řeč
4. Sestupná symetrická ochablá paralýza volních svalů.
5. Snížení hlubokých šlachových reflexů
6. Únava
7. Závratě
8. Nausea
9. Zácpa
10. Paralýza dýchacích svalů může vést ke smrti.

Nedochází k žádným smyslovým ani kognitivním deficitům

Typy botulismu

Existují tři hlavní typy lidského botulismu na základě způsobu jejich získání:

1. Botulizmus přenášený potravinami: Vzniká v důsledku konzumace potravin kontaminovaných předem připraveným botulotoxinem, jako jsou například domácí konzervy.
2. Botulismus v ranách: Jedná se o systémovou intoxikaci, která je výsledkem růstu C. botulinum a produkce toxinu v ranách. Projevuje se podobně jako potravinový botulismus s výjimkou absence gastrointestinálních příznaků.
3. Kojenecký botulismus: Kojenecký botulismus je mnohem mírnější než verze pro dospělé. Vzniká požitím potravin (obvykle medu) kontaminovaných sporami C. botulinum dětmi ve věku ≤ 1 rok. Spory klíčí ve střevě a vegetativní buňky vylučují botulotoxin. Klinické projevy zahrnují neschopnost sát a polykat, oslabení hlasu, ptózu, ochablý krk a extrémní slabost, proto se nazývá syndrom ochablého dítěte. Jedná se o samoremitující onemocnění; prognóza je vynikající, pokud je zvládnuta podpůrnou péčí a asistovanou výživou.

Spory normálně neklíčí ve střevě dospělých, mohou však klíčit ve střevě kojenců.

Laboratorní diagnostika

Diagnostika botulismu zahrnuje izolaci a identifikaci bacilů běžnými kultivačními biochemickými postupy a průkaz přítomnosti botulinum neurotoxinu ve vzorku pacienta nebo v potravinách (při vyšetřování epidemie) pomocí testu neutralizace toxinu

Prokázání botulinum toxinu (myší neutralizační test) v séru nebo ve stolici potvrzuje klinickou diagnózu botulismu.

Vzorek

Sérum, stolice, žaludeční obsah, vomitus, stěr z rány, exsudát nebo tkáně v závislosti na typu botulismu.

Přímá mikroskopie

Barvení stěrů z podezřelých potravin nebo výkalů – odhalí grampozitivní, neobalené bacily se subterminálními, oválnými, vypouklými sporami.

Kultivace

• Izolace- kultivace se provádí na krevním agaru nebo v Robertsonově vývaru z vařeného masa (RCM).
• V RCM vývaru: C. botulinum A, b, f (proteolytický)
• Pink- C. botulinum C, D, E (sacharolytický).
• Na krevním agaru: Kolonie jsou velké, nepravidelné, poloprůhledné, hemolytické, s fimbrifikovaným okrajem.

Růst na kultivačním médiu lze potvrdit barvením podle Grama, biochemickými testy nebo molekulárními testy. Sérotypizace se provádí pomocí typově specifických antisér.

Identifikační znaky Clostridium botulinum

• Pohybuje se peritrichátními bičíky.
• Vykazuje lipázovou aktivitu na žloutkovém agaru.

Toxin neutralizační test (myší biologický test)

In vivo myší biologický test je „zlatým standardem“ pro detekci aktivního botulotoxinu. Tato zkouška zahrnuje intraperitoneální injekci podezřelé kontaminované potraviny myším a pozorování po dobu 4-6 dnů, zda nedošlo k onemocnění/úmrtí.

Pokud lze tuto smrtelnou aktivitu neutralizovat (v jiné sadě myší) injekcí protilátek proti jednomu ze sérotypů botulotoxinu, potvrzuje to přítomnost botulotoxinu.

Molekulární diagnostika

Molekulární techniky, jako je polymerázová řetězová reakce (PCR) zaměřená na neurotoxinové geny, jsou ideální pro detekci a identifikaci C. botulinum. Další typizaci (například typizaci toxinů nebo genů) lze provést pomocí gelové elektroforézy s pulzním polem (PFGE) a polymorfismu délky amplifikovaných fragmentů (AFLP).

Reference a další literatura

• Tille, P. (2017). Bailey & Scottova diagnostická mikrobiologie (14. vydání). Mosby.
• Procop, G. W., & Koneman, E. W. (2016). Koneman’s Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology (7., mezinárodní vydání). Lippincott Williams and Wilkins.
• Rasooly, R., & Do, P. M. (2008). Development of an In Vitro Activity Assay as an Alternative to the Mouse Bioassay for Clostridium botulinum Neurotoxin Type A. Applied and Environmental Microbiology, 74(14), 4309-4313.
• Lindström, M., & Korkeala, H. (2006). Laboratorní diagnostika botulismu. Clinical Microbiology Reviews, 19(2), 298-314.