- Abstrakt
- 1. Úvod
- 2. Materiál a metody
- 2.1. Antigenotoxické účinky mycelia a bazidiocarpů vybraných druhů rodu Trametes na lidské bílé krvinky. Organismy a kultivační podmínky
- 2.2. Příprava houbových extraktů
- 2.3. Genoprotektivní aktivita
- 2.3.1. Subjekty
- 2.3.2. Zkoumané látky byly odebrány z krevních derivátů. Plán studie
- 2.3.3. Test gelové elektroforézy jedné buňky
- 2.4. Antioxidační aktivita
- 2.4.1. DPPH- test
- 2.4.2. Účinnost antioxidantu Stanovení celkového obsahu fenolů
- 2.4.3. Stanovení celkového obsahu flavonoidů
- 2.5. Statistická analýza
- 3. Výsledky a diskuse
- 3.1. Výsledky a diskuse. Výtěžnost extrakce
- 3.2. Genoprotektivní aktivita
- 3.3. Analýza antioxidační kapacity v buňkách Antioxidační aktivita
- 4. Závěr
- Konflikt zájmů
- Poděkování
Abstrakt
Druhy rodu Trametes se v tradiční a konvenční medicíně používají již tisíce let k léčbě různých typů onemocnění. Cílem bylo zhodnotit možné antigenotoxické účinky extraktů z mycelia a bazidiocarpů vybraných druhů rodu Trametes a posoudit závislost na jejich antioxidačním potenciálu. Studovanými druhy byly Trametes versicolor, T. hirsuta a T. gibbosa. Antigenotoxický potenciál extraktů byl hodnocen na lidských periferních bílých krvinkách s bazidiocarpovými a myceliovými extrakty těchto druhů. Alkalický kometový test byl použit k detekci zlomů řetězců DNA a alkalicky labilních míst, jakož i rozsahu migrace DNA. K hodnocení antioxidačních vlastností extraktů byl použit DPPH test. Extrakty z plodů T. versicolor a T. gibbosa ani extrakty z T. hirsuta, s výjimkou extraktu v koncentraci 20,0 mg/ml, nebyly genotoxické. Extrakt z T. versicolor měl v dávce 5,0 mg/ml největší antigenotoxický účinek jak v případě leukocytů před ošetřením, tak po něm. Extrakty z mycelia všech tří druhů neměly genotoxickou aktivitu a měly významný antigenotoxický účinek proti poškození DNA vyvolanému H2O2, a to jak v předúpravě, tak v poúpravě. Výsledky naznačují, že extrakty těchto tří druhů by mohly být považovány za silné antigenotoxické látky schopné stimulovat genoprotektivní odpověď buněk.
1. Úvod
Houby se již dlouho používají jako potravina, ale stejně tak v tradiční medicíně západního i východního světa . Přestože jsou četné houby uznávány jako zdravá potravina , jejich velký farmakologický potenciál je stále nedostatečně využíván . Na světě je známo téměř 60 druhů Trametes , ale jen několik z nich je prověřováno z hlediska léčivých vlastností . Nejznámějším léčivým druhem z tohoto rodu je Trametes versicolor (L.:Fr.) Lloyd . Tento druh, jehož lidové názvy jsou Turkey Tail (krocaní ocas) v západních kulturách, Yun-Zhi (obláčkovitá houba) v Číně nebo Kawaratake (houba u břehu řeky) v Japonsku, se používá již tisíce let v tradiční medicíně, zejména v Asii . Podle Compendium of Chinese Materia Medica, sepsaného za dynastie Ming, bylo zaznamenáno více než 120 kmenů T. versicolor a v tradiční čínské léčebné praxi je tato houba považována za užitečnou pro odstraňování toxinů, posilování, zvyšování energie, zlepšování funkce jater a sleziny a posilování imunitní reakce, zejména když se usuší, rozemele a připraví na čaj . Všechny tyto vlastnosti byly v lidovém léčitelství považovány za velmi užitečné při chronickém užívání přípravků z Trametes spp. V konvenční medicíně se tento druh používá především k léčbě různých typů rakoviny, ale také při chronické hepatitidě, revmatoidní artritidě a infekcích dýchacích, močových a trávicích cest, což potvrdily četné studie . Kromě toho byly zaznamenány silné antivirové účinky některých polysacharopeptidů izolovaných z T. versicolor a významná antioxidační aktivita extraktů z plodnic Trametes spp. Tyto účinky jsou založeny především na produkci polysacharidu krestinu (PSK) a různých polysacharid-peptidových komplexů, což jsou sloučeniny, které omezují metastázy rakoviny a stimulují produkci interleukinu-1 v lidských buňkách .
Hojná přítomnost volných radikálů v životním prostředí je spojena se vznikem oxidačního stresu, který je základem stárnutí a vzniku a průběhu různých onemocnění a poruch, na které trpí a umírá velká část světové populace . DNA je na oxidační poškození citlivější než jiné makromolekuly. Poškození DNA, jako jsou zlomy vláken, mohou být vyvolány různými činiteli, mezi nimiž má H2O2 genotoxický účinek. Je známo, že tato poškození mohou ovlivnit imunitní odpověď nejen u zánětlivých onemocnění, ale také u nádorových onemocnění . Kometový test je dobře zavedený a účinný test s vysokou citlivostí, který se používá ke zkoumání poškození DNA a který lze použít k posouzení genotoxického a ochranného potenciálu několika přírodních produktů .
Genoprotektivní aktivita extraktů z hub založená na snížení oxidačního poškození DNA může také hrát významnou roli v prevenci a léčbě několika zmíněných onemocnění a poruch, ale jen velmi málo studií ji do dnešní doby považovalo za možný nástroj působení v různých terapiích . Cílem studie proto bylo zhodnotit antigenotoxické účinky extraktů z mycelia a bazidiocarpů vybraných druhů rodu Trametes na lidské periferní bílé krvinky a posoudit závislost na jejich antioxidačním potenciálu.
2. Materiál a metody
2.1. Antigenotoxické účinky mycelia a bazidiocarpů vybraných druhů rodu Trametes na lidské bílé krvinky. Organismy a kultivační podmínky
Kultury Trametes versicolor BEOFB 321, T. hirsuta BEOFB 301 a T. gibbosa BEOFB 310 byly izolovány z plodnic odebraných v Srbsku a udržovány na agarovém médiu Malt ve sbírce kultur Ústavu botaniky Biologické fakulty Univerzity v Bělehradě (BEOFB).
Inokulum bylo připraveno inokulací 100,0 ml syntetického média (glukóza, 10. K.).0 g L-1; NH4NO3, 2,0 g L-1; K2HPO4, 1,0 g L-1; , 0,4 g L-1; , 0,5 g L-1; kvasničný extrakt, 2,0 g L-1; pH 6,5) s 25 myceliovými disky (Ø 0.5 cm, ze sedmidenní kultury ze sladového agaru) v baňkách o objemu 250 ml a inkubace na rotační třepačce při 100 ot/min, při pokojové teplotě (°C) po dobu 7 d. Vzniklá biomasa byla promyta a homogenizována 100,0 ml sterilní destilované vody (dH2O) v laboratorním mixéru. Homogenizovaná biomasa (30,0 ml) byla použita k inokulaci 500,0 ml modifikovaného syntetického média (s obsahem glukózy 65,0 g L-1). Submerzní kultivace probíhala v 1000 ml baňkách při pokojové teplotě na rotační třepačce po dobu 21 d. Získaná biomasa byla filtrována, třikrát promyta dH2O na magnetickém míchadle a vysušena při 50 °C do konstantní hmotnosti.
2.2. Příprava houbových extraktů
Sušené plodnice a mycelium (3,0 g) byly extrahovány mícháním s 90,0 ml 96% ethanolu při 30 °C po dobu 72 hodin. Vzniklé extrakty byly odstředěny (20 °C, 3000 ot./min, 15 min) a supernatanty byly přefiltrovány přes filtrační papír Whatman číslo 4, zahuštěny za sníženého tlaku na rotační odparce (BÜCHI R-114, Švýcarsko) při 40 °C do sucha a znovu rozpuštěny v 96% ethanolu pro antioxidační test nebo ve vodě pro antigenotoxický test na počáteční koncentraci 20,0 mg ml-1. Extrakční výtěžek byl vyjádřen v procentech na základě hmotnosti sušiny.
2.3. Genoprotektivní aktivita
2.3.1. Subjekty
Vzorky heparinizované plné krve byly získány venepunkcí od tří zdravých dárců ve věku do 25 let. Účastníci studie byli nekuřáci a nealkoholici, neužívali žádnou léčbu ani léky a neužívali doplňky stravy.
2.3.2. Zkoumané látky byly odebrány z krevních derivátů. Plán studie
Genotoxicita všech extraktů a koncentrací (20,0, 10,0, 5,0, 2,5, 1,25, 0,625 a 0,312 mg ml-1) byla studována působením na lidské periferní bílé krvinky při 37 °C po dobu 30 minut s cílem vyhodnotit poškození DNA. Obvykle se používají bílé krvinky, protože se získávají relativně neinvazivním způsobem, nevyžadují dezagregaci tkáně a dobře se chovají v kometovém testu . Jako pozitivní kontrola bylo použito ošetření fosfátovým pufrovaným roztokem (PBS) při 37 °C po dobu 30 min a jako negativní kontrola ošetření 25,0 μM H2O2 na ledu po dobu 15 min.
K hodnocení antigenotoxického potenciálu extraktů byly použity dva nezávislé protokoly s použitím předběžného ošetření a následného ošetření extrakty. Při předběžném ošetření byly buňky inkubovány s extrakty při 37 °C po dobu 30 min, poté promyty PBS a vystaveny H2O2 po dobu 15 min. Při následném ošetření byly buňky ošetřeny H2O2 na ledu po dobu 15 min, opláchnuty PBS a následně ošetřeny sedmi koncentracemi extraktu při 37 °C po dobu 30 min. Po každém ošetření byly buňky promyty PBS. Inkubace s PBS při 37 °C po dobu 30 min představovala negativní kontrolu a ošetření 25,0 μM H2O2 na ledu po dobu 15 min představovalo pozitivní kontrolu.
Pro každý experiment byly provedeny tři opakování a pro každé bylo analyzováno 100 jader.
2.3.3. Test gelové elektroforézy jedné buňky
Kometový test byl proveden podle popisu Singha a kol. Alkalický kometový test je schopen detekovat zlomy řetězců DNA a alkalicky labilní místa a rozsah migrace DNA indikuje stupeň poškození DNA v buňkách.
Vzorky plné krve (6,0 μl) byly suspendovány v 0,67% agaróze s nízkým bodem tání (LMP) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a pipetovány na přemražená skleněná mikroskopická sklíčka předem pokrytá vrstvou 1% agarózy s normálním bodem tání (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), rozetřeny pomocí krycího sklíčka a ponechány na ledu po dobu 5 min, aby ztuhly. Po opatrném odstranění krycích sklíček byly buněčné suspenze na sklíčkách ošetřeny extrakty a H2O2, jak je popsáno výše. Po ošetření byla všechna sklíčka pokryta třetí vrstvou 0,5% LMP agarosy a opět se nechala 5 min tuhnout na ledu. Po odstranění krycích sklíček byla sklíčka umístěna do studeného lyzovacího roztoku (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, 1 % Triton X100 a 10 % dimethylsulfoxid, pH 10,0 upravené NaOH) při 4 °C přes noc a poté byla podrobena elektroforéze a barvení ethidiumbromidem. Komety byly pozorovány a analyzovány pomocí mikroskopu Olympus ×50 (Olympus Optical Co., Gmbh Hamburg, Německo), vybaveného zařízením pro záznam fluorescence při 100násobném zvětšení. Hodnocení poškození DNA bylo provedeno podle popisu Andersona a kol. Konkrétně byly buňky okem rozděleny do pěti kategorií odpovídajících následujícímu množství DNA v ocásku: (A) žádné poškození, <5 %; (B) nízká úroveň poškození, 5-20 %; (C) střední úroveň poškození, 20-40 %; (D) vysoká úroveň poškození, 40-95 %; (E) celkové poškození, >95 % (obr. 1). Analýza byla provedena na 100 náhodně vybraných buňkách na subjekt (50 buněk z každého ze 2 opakovaných preparátů). Pro získání semikvantitativní analýzy dat bylo poškození DNA charakterizováno jako migrace DNA nad 5 % (B + C + D + E kometové třídy).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
2.4. Antioxidační aktivita
2.4.1. DPPH- test
Antioxidační aktivita byla definována měřením vybělení fialově zbarveného methanolového roztoku stabilního 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazylového radikálu () . Scavengingové účinky byly měřeny spektrofotometricky (CECIL CE 2501) při 517 nm a vypočteny pomocí rovnice:kde je absorbance negativní kontroly (reakční směs bez extraktu) a je absorbance reakční směsi.
Koncentrace extraktu (mg extraktu/ml) zajišťující 50% redukci (EC50) byla získána interpolací z lineární regresní analýzy. Všechna měření byla provedena ve třech opakováních pro statistickou analýzu. Jako pozitivní kontrola byl použit komerční antioxidant, butylovaný hydroxyanizol (BHA), v koncentračním rozmezí 20,0 mg ml-1-0,02 mg ml-1.
2.4.2. Účinnost antioxidantu Stanovení celkového obsahu fenolů
Celkový obsah fenolových sloučenin v myceliálních extraktech byl stanoven pomocí Folin-Ciocalteuova činidla podle metody Singletona a Rossiho , přičemž jako standard byla použita kyselina gallová. Koncentrace byla stanovena jako μg ekvivalentů kyseliny gallové (GAE) na mg suchého extraktu pomocí rovnice, která byla získána ze standardního grafu kyseliny gallové jako
2.4.3. Stanovení celkového obsahu flavonoidů
Celkový obsah flavonoidů byl stanoven metodami Parka a kol. za použití kvercetinu jako standardu. Množství bylo vyjádřeno jako μg ekvivalentů kvercetinu (QE) na mg suchého extraktu pomocí rovnice získané z grafu standardního hydrátu kvercetinu jako
2.5. Statistická analýza
Výsledky byly vyjádřeny jako průměr ± standardní chyba údajů získaných ze tří paralelních měření. K testování případných významných rozdílů byla provedena jednosměrná analýza rozptylu (ANOVA) pomocí softwaru STATISTIKA, verze 5.0 (StatSoft Inc.). hodnoty menší než 0,01 byly považovány za statisticky významné. Statistická analýza údajů z kometového testu byla provedena χ2 testem pomocí softwaru Statgraph 4.2. Pro provedení χ2 testu byly výsledky ze tří experimentů sloučeny a byl vyhodnocen celkový počet buněk s poškozením DNA. Rozdíl při byl považován za statisticky významný.
3. Výsledky a diskuse
3.1. Výsledky a diskuse. Výtěžnost extrakce
Výtěžnost extrakce biomasy mycelia byla u všech tří druhů významně vyšší ve srovnání s výtěžností plodnice (). T. gibbosa měla nejvyšší výtěžnost extrakce ze sušené biomasy mycelia (34,6 %) a nejnižší výtěžnost ze sušených plodenství (2,2 %). Nejvyšší výtěžnost extrakce plodenství 6,67 % byla zjištěna u T. versicolor, jejíž výtěžnost extrakce mycelia byla 8,0 %. Výtěžnost u T. hirsuta byla 12,0 % (pro mycelium) a 2,85 % (pro plodenství). Rozdíly v účinnosti extrakce mezi druhy, jak pro mycelium, tak pro plodenství, byly statisticky významné ().
Předchozí zprávy ukázaly závislost extrahovatelnosti biomasy na druhu, kmeni a rozpouštědle . Ren et al. tak zjistili, že výtěžnost extrakce bazidiocarpu T. gibbosa byla 1,22 % pro petroletherový extrakt, 6,44 % pro ethylacetátový a 9,2 % pro methanolový extrakt. Methanol byl také dobrým rozpouštědlem pro bazidiocarp T. versicolor, jehož výtěžnost se pohybovala mezi 4,1 % a 9,16 % . Na základě našich výsledků lze vyvodit závěr, že alkoholy jsou nejlepšími rozpouštědly, ale ethanol je slabší než methanol.
3.2. Genoprotektivní aktivita
Jelikož všichni dárci krve byli v dobrém zdravotním stavu a podobného věku a nebyli léčeni žádnými léky, statistická analýza neprokázala žádné jasné rozdíly v jejich reakcích na extrakty. Proto byly výsledky ze tří experimentů sloučeny. Ošetření leukocytů periferní krve H2O2 způsobilo rychlou a silnou indukci jednovláknových zlomů v jaderné DNA, což se projevilo v kometovém testu jako migrace DNA.
Naše výsledky prokázaly, že extrakty z plodnic T. versicolor od 0,312 do 20.0 mg ml-1 nezpůsobil žádné významné zvýšení celkového počtu buněk poškozených DNA ve srovnání s pozitivní kontrolou, což jasně ukazuje, že testovaný extrakt nebyl genotoxickou látkou (obrázek 2(a) (A)). Rozložení (hodnota) celkového poškození DNA bylo rovněž stejné jako u pozitivní kontroly. Na druhou stranu tyto extrakty vykazovaly ochranné účinky proti H2O2 jak v případě leukocytů před ošetřením, tak po něm (obrázek 2(a) (B, C)). Extrakt v dávce 5,0 mg ml-1 měl největší účinek a v dávce 20,0 mg ml-1 nejmenší účinek v obou ošetřeních. Hodnota celkového poškození DNA se ve srovnání s pozitivní kontrolou statisticky snížila ve všech koncentracích ().
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Extrakt z plodnice T. hirsuta ve všech koncentracích kromě 20,0 mg ml-1 nevykazoval žádnou genotoxickou aktivitu, protože úroveň celkového poškození DNA nebyla statisticky vyšší než u pozitivní kontroly (Obrázek 2b) (A)). Při koncentraci 20,0 mg ml-1 se však genotoxický účinek a celkové poškození DNA v buňkách statisticky lišily ve srovnání s pozitivní kontrolou. V přípravcích před a po ošetření leukocytů vykazoval extrakt ve všech koncentracích kromě nejvyšší ochranný účinek proti poškození DNA vyvolanému H2O2 a vykazoval významné snížení celkového poškození DNA ve srovnání s pozitivní kontrolou (obrázek 2b) (B, C)). Tato ošetření vykazovala závislost na dávce, přičemž největší ochranný účinek byl zaznamenán při koncentraci extraktu 0,312 mg ml-1 , zatímco koncentrace 20 mg ml-1 nevykazovala žádnou ochranu proti kometám indukovaným H2O2.
Neexistence genotoxického i významného antigenotoxického účinku, tj. snížení poškození DNA indukovaného H2O2, byla v případě extraktu z plodenství T. gibbosa v sedmi koncentracích zaznamenána rovněž před i po ošetření (obrázek 2(c)). Na rozdíl od extraktů z T. hirsuta však u extraktů z bazidiocarpů T. gibbosa nebyla pozorována odezva závislá na dávce; postupný pokles koncentrace extraktu totiž neodpovídal proporcionálnímu snížení genotoxicity vyvolané H2O2.
Extrakty z mycelia T. versicolor, T. hirsuta a T. gibbosa ve všech analyzovaných koncentracích nevykazovaly žádnou genotoxickou aktivitu (obr. 3(a) (A), 3(b) (A) a 3(c) (A)). Všechny extrakty a koncentrace mycelia vykazovaly významný antigenotoxický účinek proti poškození DNA vyvolanému H2O2, a to jak v období před, tak po ošetření, přičemž tyto aktivity se výrazně nelišily. U T. versicolor byla mírně nižší aktivita zaznamenána u nejnižší koncentrace extraktu. U T. hirsuta byly účinnější koncentrace 5,0, 2,5 a 20,0 mg ml-1 , zatímco u T. gibbosa byl největší ochranný účinek pozorován při koncentraci 2,5 mg ml-1 a nejnižší při 20,0 mg ml-1 (obr. 3 a) (B, C), 3 b) (B, C) a 3 c) (B, C)).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Mnoho mutagenních a karcinogenních sloučenin je přítomno v různých přírodních zdrojích . Na druhou stranu některé přírodní sloučeniny mohou být buď prooxidanty způsobujícími genotoxické a/nebo cytotoxické účinky, nebo antioxidanty, v závislosti na koncentraci a délce expozice . Vysoce nutriční a lékařsky ceněné druhy hub mohou mít různé účinky in vitro a in vivo, a to buď z důvodu jejich nestability v podmínkách trávení, nebo neschopnosti vstřebávání gastrointestinálním traktem . Konkrétně aktivity získané in vitro nemusí nutně odpovídat aktivitám zjištěným in vivo. Je také důležité zdůraznit, že genotoxické a antigenotoxické účinky extraktů z hub závisí na druhu, koncentraci a testu použitém pro jejich hodnocení . Naše výsledky tak prokázaly rozdílnou schopnost tří druhů Trametes snižovat poškození DNA vyvolané H2O2; například nejnižší aktivita byla zaznamenána u extraktu z plodnic T. hirsuta. Zřetelný inverzní vztah mezi úrovní poškození DNA a koncentrací extraktu byl zaznamenán pouze u extraktu z bazidiocarpu T. hirsuta. U T. versicolor a T. gibbosa však zvýšení koncentrace extraktu nad optimální dávku nevedlo ke zlepšení výsledků kometování, což potvrzuje výsledky Miyaji et al. Tito autoři prokázali absenci vztahu mezi koncentrací extraktu z Lentinus edodes a jeho antigenotoxickým účinkem. Je důležité zmínit, že kombinace fenolických, flavonoidních a dalších složek v extraktech by měla mít větší potenciál než jednotlivé složky extraktů, což ukazuje na význam spolupůsobení všech složek . Toto zjištění by mohlo vést k odlišnému trendu antigenotoxické aktivity Trametes spp. Závislost genotoxické aktivity extraktu na typu testu prokázali Morales et al. ; tj. uvedli nepřítomnost mutagenního účinku extraktů z bazidiocarpů Lactarius deliciosus, Boletus luteus, Agaricus bisporus a Pleurotus ostreatus na savčí buňky pomocí Amesova salmonelového/mikrozomového testu. Slabá aktivita extraktu P. ostreatus však byla získána pomocí testu CHO/HPRT.
Základní mechanismy antigenotoxického účinku extraktů hub nejsou dosud zcela známy. Zdá se, že ochranné účinky extraktů jsou založeny na více než jednom mechanismu účinku, což podle Gebharta není u hub neobvyklé . Mechanismy antigenotoxicity by mohly být hodnoceny aplikací pre- a post-ošetření, tj. různorodých kombinací extraktů a H2O2. Naše pozitivní výsledky u obou ošetření naznačují, že extrakty mají ochranné účinky na úrovni prevence i intervence a mohou působit jako desmutageny a bioantimutageny, což prokázaly i předchozí studie . Účinnost předběžného ošetření, zaznamenanou v této studii, lze vysvětlit zvýšením antioxidační kapacity buněk, tj. stimulací syntézy a aktivity antioxidačních enzymů během indukce oxidačního stresu . Pozitivní účinek následné léčby by mohl být výsledkem synergického působení intervenčních aktivit prostřednictvím vymývání volných radikálů a stimulace antioxidačních enzymů, jakož i excitace reparace DNA, jak naznačují Chiaramonte et al . Vzhledem k tomu, že tito autoři zaznamenali významnou opravu poškození DNA po 30-60 min expozice oxidačnímu činidlu, lze usuzovat, že oprava DNA hrála v ochraně proti H2O2 méně významnou roli, protože podmínky po ošetření uvažovaly až 30 min inkubace. Genoprotektivní aktivita extraktů Trametes spp. je tedy pravděpodobně založena na antioxidačních účincích. Na druhou stranu je známo, že eukaryotické organismy vyvinuly signální dráhu zvanou odpověď na poškození DNA, která chrání před genomovými inzulty. Gasser a Raulet prokázali, že odpověď na poškození DNA varuje imunitní systém tím, že indukuje expresi povrchových buněčných ligandů pro aktivační imunitní receptor NKG2D, který je exprimován přirozenými zabíječi (NK buňkami) a některými T buňkami. Genoprotektivní aktivita Trametes spp. v buňkách vystavených genotoxickým látkám by tedy mohla modulovat odpověď na poškození DNA a fungovat jako bariéra v časné fázi nádorového bujení. Další výzkumy by měly zahrnovat analýzu hladin superoxiddismutázy a katalázy v lymfocytech ošetřených extrakty z Trametes spp. před i po ošetření H2O2, aby se potvrdil předpoklad, že zvýšení antioxidační kapacity v buňkách je vyvoláno těmito extrakty.
3.3. Analýza antioxidační kapacity v buňkách Antioxidační aktivita
Testované ethanolové extrakty byly dobrými antioxidanty, ale jejich aktivita závisela na druhu. Extrakty z plodenství vykazovaly výrazně vyšší scavengingové účinky než extrakty z mycelia (). Nejvyšší aktivita vychytávání DPPH radikálů byla zjištěna u extraktů z T. versicolor, a to jak z plodenství, tak z mycelia (63,5 %, resp. 59,4 %), což potvrdily hodnoty EC50 (15,22 mg ml-1 a 16,18 mg ml-1, resp.). O něco nižší aktivita byla zjištěna u extraktů T. hirsuta (59,0 % pro bazidiocarpus a 46,8 % pro mycelium), jejichž koncentrace 17,06 mg ml-1 a 21,81 mg ml-1 zajistily 50% redukci radikálů. T. gibbosa byla druhem s nejnižším scavengingovým potenciálem, zejména u extraktů z mycelia (39,7 %) s hodnotou EC50 26,15 mg ml-1. Schopnost vymývání radikálů u extraktu z plodenství však nebyla ve srovnání s ostatními dvěma druhy výrazně nižší (53,7 % a EC50 18,13 mg ml-1). Scavengingová aktivita syntetického antioxidantu BHA byla 94,28 % a koncentrace 0,10 mg ml-1 zajistila redukci 50 %.
Celkové obsahy fenolů v extraktech z plodenství a mycelia druhů rodu Trametes se významně lišily () (tab. 1). Obecně byly obsahy fenolů v extraktech z plodenství vyšší než v extraktech z mycelia.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nejbohatší na fenoly a flavonoidy byly extrakty z bazidiocarpu T. versicolor a mycelia T. versicolor, zatímco nejnižší koncentrace byly naměřeny v extraktech T. gibbosa. Podle koncentrací fenolů a flavonoidů se extrakty T. hirsuta umístily mezi extrakty ostatních dvou druhů (tab. 1). Míra korelace mezi scavengingovou aktivitou extraktů a obsahem fenolů a flavonoidů byla vysoká, u plodnic 0,98, resp. 0,99, a u mycelia 0,97, resp. 0,99.
Předchozí studie rovněž naznačily antioxidační potenciál druhů rodu Trametes . Tak Kamiyama a kol. prokázali, že extrakt o koncentraci dokonce 0,5 mg ml-1 vychytal téměř 50 % v závislosti na rozpouštědle, zatímco Johnsy a Kaviyarasana zaznamenali redukci dokonce 91,5 % radikálů methanolovým extraktem bazidiocarpů T. gibbosa o koncentraci 1,0 mg ml-1 . Etanolové extrakty testované v naší studii měly o něco nižší kapacitu, ale vyšší než etanolové extrakty z plodenství T. hirsuta analyzované Sheikhem et al. .
Podle Mau et al. a Palaciose et al. hrají fenolické sloučeniny klíčovou roli v antioxidační aktivitě. Tyto sloučeniny jsou velmi hojné a důležité složky plodnic a mycelia hub. Jejich schopnost je založena na přítomnosti hydroxylových skupin působících jako redukční činidla, chelátory kovů, zhášeče singletového kyslíku a donory vodíku . V některých případech však jejich aktivitu nelze přisuzovat celkovému obsahu fenolů v extraktech, což potvrzuje srovnání našich výsledků s výsledky Johnsyho a Kaviyarasana . Konkrétně 91,5 % bylo redukováno extraktem z bazidiocarpu T. gibbosa obsahujícím 23,8 μg GAE mg-1 extraktu, zatímco extrakt kmene BEOFB 310 s koncentrací fenolu 20,07 μg GAE mg-1 extraktu vychytal pouze 63,5 % radikálů. Koncentrace flavonoidů v srbském kmeni T. gibbosa však byla výrazně vyšší ve srovnání s kmenem testovaným Johnsym a Kaviyarasanou (7,63 μg QE mg-1 extraktu, resp. 0,59 μg QE mg-1 extraktu), což lze vysvětlit různou polaritou rozpouštědel i rozdílnou kapacitou kmene pro syntézu flavonoidů .
4. Závěr
Studie byla prvním pokusem o posouzení ochranné aktivity DNA extraktů T. versicolor, T. hirsuta a T. gibbosa a určuje, zda byla založena na jejich antioxidačním potenciálu. Výsledky naznačují, že extrakty těchto tří druhů by mohly být považovány za silné antigenotoxické látky schopné stimulovat genoprotektivní reakci buněk přispívající ke zvýšení imunitní funkce, odstranění toxinů a posílení, což odkazuje na tradiční použití. K odhalení konkrétních nositelů antigenotoxické aktivity a způsobu ochrany DNA před oxidativním poškozením je však nutné další zkoumání.
Konflikt zájmů
Autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů v souvislosti s publikováním tohoto článku.
Poděkování
Autoři děkují profesoru Dr. Stevu Quarriemu, hostujícímu profesorovi na univerzitě v Newcastlu ve Velké Británii, za revizi a zlepšení angličtiny. Tato studie byla provedena s finanční podporou Ministerstva školství, vědy a technologického rozvoje Republiky Srbsko, projekt č. 173032 a projekt č. 173034.
Napsat komentář