Trp53 noll och R270H mutant alleler har jämförbara effekter när det gäller att reglera invasion, metastasering och genuttryck i musens tjocktarmstumörutveckling

Missense och noll Trp53 mutationer främjar musens tjocktarmstumörutveckling i CDX2P-CreER T2 Apc fl/+ , Kras LSL-G12D (AK) möss

För att utveckla en modell för tjocktarmstumörer hos möss som initieras av genfel som de som ofta förekommer i mänskliga tjocktarmstumörer, genererade vi sammansatta muterade möss som bär på en floxerad Apc-allel (Apcflox, 580S, förkortat A) som kan inaktiveras genom Cre-rekombinasfunktion och en floxerad, latent onkogen allel av Kras (KrasLSL-G12D, förkortat K) som kan aktiveras genom Cre-rekombination. Med hjälp av CDX2P-CreERT2-transgenen och TAM-behandling för att aktivera Cre-funktionen i kolonens epitelceller riktade vi in oss på Apc- och Kras-allelerna i epitelet i distala ileum, cecum och kolon. Medan CDX2P-CreERT2 K-möss visar ett serrerat och hyperplasiskt kolonepitel hade CDX2P-CreERT2AK (AK)-mössen ett serrerat och hyperplastiskt kolonepitel och utvecklade dessutom i genomsnitt 13 adenom med en storlek från 0,5 mm till 2 mm vid den tidpunkt då de humana slutpunkterna för mössen uppnåddes 10-15 månader efter TAM-behandlingen (fig. 1a). Hos sex av tio AK-möss hittade vi ett eller två adenokarcinom som uppstod i cecum. Av de totalt åtta adenokarcinom som hittades hos de 10 AK-möss som studerades invaderade sju tumörer in i muscularis propria (MP) eller djupare och fem nådde sub-serosa eller serosa (fig. 1b, tabell 1 och kompletterande tabell 1). Eftersom endast 8 av 131 observerade tumörer hos AK-mössen var invasiva, innebär dock resultaten att ytterligare somatiska defekter utöver Apc- och Kras-mutationer krävdes för utveckling av invasiva tjocktarmstumörer hos AK-mössen.

Missense och noll Trp53-mutationer främjar musens kolon-tumörprogress i CDX2P-CreERT2 Apcfl/+, KrasLSL-G12D (AK) möss. a Kaplan-Meier överlevnadskurvor för CDX2P-CreERT2AK (AK) möss (n = 10, medianöverlevnad = 336 dagar), CDX2P-CreERT2AKP270/+ (AKP270/+) möss (n = 16, medianöverlevnad = 166 dagar), CDX2P-CreERT2AKPfl/fl (AKPfl/fl) möss (n = 16, medianöverlevnad = 97 dagar) och CDX2P-CreERT2AKP270/fl (AKP270/fl) möss (n = 20, medianöverlevnad = 88 dagar). TAM administrerades dagligen under två dagar och tid noll representerar den andra av dessa dagar. P-värden erhölls genom log-rank-test vid följande jämförelser: P = 1,4E-6 för AK jämfört med AKP270/+; P = 1,4E-7 för AKPfl/fl jämfört med AKP270/+; P = 1,9E-8 för AKP270/fl jämfört med AKP270/+. b Procent av tjocktarmstumörer med olika invasionsdjup från AK-möss, AKP270/+-möss, AKPfl/fl-möss och AKP270/fl-möss. Data är från flera lesioner per mus (n = 10-14 möss per grupp). P-värden baserade på Fisher Exact-test och Exact Poisson-test visas i tabell 1 respektive kompletterande tabell 1. Felstaplar är standardfel för medelvärdet. A adenom, SM submucosa, MP muscularis propria, SS subserosa, S serosa. c, d Färgning med hematoxylin och eosin (H&E) av representativa invasiva tumörer från vävnader från proximal kolon (höger) och cecum (vänster) visas för AKP270/fl-möss (c) och AKPfl/fl-möss (d). Tumörerna i (c) och (d) samlades in 3 månader efter TAM-injektion. Bilder med hög förstoring visas i de nedre panelerna och är inramade i de lägre förstorade områdena i motsvarande övre paneler. De streckade linjerna anger gränsen mellan muskelskiktet och subserosa. Skalstreck: 500 μm för bilden med låg förstoring (övre panelerna); 100 μm för bilder med hög förstoring (nedre paneler)

Som nämnts ovan hittas TP53-mutationer i cirka 60 % av mänskliga tjocktarmscancer och tycks selekteras under adenom- och karcinomutvecklingen . Vi försökte bedöma samarbetet mellan Trp53-inaktivering och Apc- och Kras-mutationer vid kolon-tumörprogression in vivo, samt avgöra om potentiella GOF-effekter av en Trp53-missense-mutantallel kunde ses i modellen. Vi introducerade en konstitutiv Trp53R270H-mutantallel (den murina motsvarigheten till mänsklig R273H, kallad P270) och/eller en villkorlig nollallel Trp53flox (kallad Pfl) i AK-modellen. Möss med sammansatta genotyper genererades och deras förkortningar är följande: CDX2P-CreERT2AKP270/+ (AKP270/+-möss), CDX2P-CreERT2AKP270/fl (AKP270/fl-möss) och CDX2P-CreERT2AKPfl/fl (AKPfl/fl-möss). Kohorter av vuxna AKP270/+-, AKP270/fl- och AKPfl/fl-möss inducerades för kolontumörer via TAM-behandling och deras hälsotillstånd övervakades. Jämfört med AK-möss (medianöverlevnad = 336 dagar) hade AKP270/+-, AKP270/fl- och AKPfl/fl-mössen alla betydligt kortare livslängd. AKP270/fl- och AKPfl/fl-mössen hade en medianöverlevnad på 88 respektive 97 dagar, och AKP270/+-mössen hade en medianöverlevnad på 166 dagar (fig. 1a). AKP270/+-mössen hade signifikant längre överlevnad än AKP270/fl- och AKPfl/fl-möss (P < 0,0001 för var och en jämfört med AKP270/+-möss), men ingen statistiskt signifikant skillnad i överlevnad sågs när man jämförde AKP270/fl- och AKPfl/fl-möss (fig. 1a). Tillägget av Trp53-mutation(er) (R270H eller null) ökade signifikant den totala tumörincidensen i förhållande till den som sågs hos AK-möss (P < 0,0001 för både AKPfl/fl och AKP270/fl, jämfört med AK-möss, kompletterande tabell 1 nere till vänster). AKP-möss hade också flera kolon- och cecumtumörer som uppvisade invasiva egenskaper (7,3 och 8,9 invasiva tumörer per mus för AKPfl/fl-möss respektive AKP270/fl-möss) jämfört med AK-möss (0,8 invasiva tumörer per mus; fig. 1b och kompletterande tabell 1 överst till höger, P < 0,0001 för både AKPfl/fl vs. AK och AKP270/fl vs. AK jämförelser).

Djupgående analys av vävnader från musens cecum och kolon som erhållits vid obduktion definierade den omfattande tumörbördan hos AKP270/+, AKPfl/fl och AKP270/fl möss, med lesioner som sträcker sig från adenom till adenokarcinom i sent skede (fig. 1b-d och tabell 1). Alla studerade AKP270/+-, AKPfl/fl- och AKP270/fl-möss bar på minst ett adenokarcinom (tumörer med submucosa eller djupare invasion). Bevis på invasion till glatt muskulatur och, i vissa fall, till serosa hittades i både cecum och proximala kolonregioner hos AKP270/fl- och AKPfl/fl-möss (fig. 1c respektive d). AKP270/+-mössen, där Cre-targeted epitelceller initialt behåller en funktionell Trp53-allel av vildtyp, hade en längre latenstid för tumörutveckling och den totala tumörbördan (18,5 per mus) och procentandelen tumörer med djupare invasion (11.9 %) var betydligt lägre jämfört med AKP270/fl- eller AKPfl/fl-möss (Kompletterande tabell 1 och tabell 1, P < 0,01 jämfört med AKP270/fl- eller AKPfl/fl-möss för tumörbörda per mus och andelar adenokarcinom). Dessa resultat stöder uppfattningen att p53 av vildtyp har en tumörundertryckande funktion i kolon-tumörigenesen även i samband med en Trp53 missense mutant allel. När alla observerade tumörer jämfördes mellan AKP270/fl- och AKPfl/fl-möss fann vi att andelen adenokarcinom med submucosainvasion eller djupare invasion var högre hos AKP270/fl-möss än hos AKPfl/fl-möss (36,9 % och 26,1 % för AKP270/fl- och AKPfl/fl-möss, respektive; tabell 1, P = 0,0026), vilket tyder på en möjlig blygsam GOF-effekt för R270H Trp53-allelen när det gäller att öka vävnadsinvasion. Den blygsamma ökningen av den invasiva potentialen hos AKP270/fl-möss kan dock uppvägas, eftersom den genomsnittliga tumörbördan per mus tenderade att vara högre hos AKPfl/fl-möss än hos AKP270/fl-möss (28,0 vs 24,2 per mus, P = 0.054; kompletterande tabell 1), och AKPfl/fl- och AKP270/fl-mössen uppvisade inga signifikanta skillnader i förekomsten av adenokarcinom (7,3 vs 8,9 adenokarcinom per mus, kompletterande tabell 1 överst till höger, P = 0,16). Vidare sågs invasion av vissa tumörer i muscularis propria, subserosa eller serosa hos både AKP270/fl- och AKPfl/fl-möss (fig. 1b och tabell 1). Eftersom endast cirka 30 % av tumörerna från AKP270/fl- eller AKPfl/fl-möss utvecklades till adenokarcinom under studieperioden är ytterligare somatiska förändringar utöver Apc-, Kras- och Trp53-defekter troligen avgörande för att generera karcinom hos AKP-möss.

Tumörhistologi och metastasering hos AKP270/fl- eller AKPfl/fl-möss

Varje AKP270/fl- och AKPfl/fl-mus utvecklade ett eller flera adenokarcinom när de humana slutpunkterna nåddes. I AKP270/fl-möss visade mer än 80 % av adenokarcinomen väl till måttligt differentierade egenskaper, med tumörknoppning/spridning vid invasionsfronten och enstaka mucinutsöndring (fig. 2a, överst). Ungefär 15-20 % av AKP270/fl-adenokarcinomen var dåligt differentierade, med en solid morfologi av trabekulär typ (fig. 2a, mitten). Sällsynta signet-ringcellskarcinom sågs hos AKP270/fl-möss (fig. 2a, nederst). I AKPfl/fl-möss var cirka 50 % av adenokarcinomen väl till måttligt differentierade med mucinutsöndring (fig. 2b, överst); resten var dåligt differentierade (fig. 2b, nederst). Kraftig nukleär och cytoplasmatisk färgning av β-catenin sågs i invasiva AKP270/fl- och AKPfl/fl-tumörer (fig. 2, mitten), vilket stämmer överens med defekt Wnt-signalering till följd av Apc-inaktivering. Kraftig nukleär färgning för p53 observerades i AKP270/fl tumörceller. Som förväntat sågs ingen p53-färgning i AKPfl/fl tumörceller (fig. 2, höger).

Histologiska typer av kolonaradenokarcinom från p53-mutanta möss. H&E-färgningar (vänstra paneler) och immunohistokemiska färgningar för β-catenin (mellersta paneler) och p53 (högra paneler) visas för oberoende kolon-tumörer av representativa histologiska typer från AKP270/fl-möss (a) och AKPfl/fl-möss (b). Tumörerna samlades in 3 månader efter TAM-induktion. Skala: 50 μm

Vid obduktion hittades lymfkörtelmetastaser hos 3 av 13 AKPfl/fl-möss och 5 av 14 AKP270/fl-möss (tabell 2). Bland de tre AKPfl/fl-möss som var och en hade metastaser till en buklymfkörtel hade en mus också flera metastaser till lungan och en annan mus hade flera metastaser till levern (tabell 2). Bland de fem AKP270/fl-möss som var och en hade metastaser till en abdominal lymfkörtel hade en mus flera metastaser till lungan och en annan hade metastaser i både lunga och lever (tabell 2). Inga metastatiska lesioner hittades hos AK- eller AKP270/+-möss (tabell 2). Våra data tyder på att CRC-möss med missense- eller nullmutationer i Trp53 kan ge upphov till spontana lymfkörtel- och fjärrmetastaser i jämförbara frekvenser, vilket talar emot en GOF-effekt för missense Trp53-mutationer när det gäller att öka metastasering i vår CRC-modell för möss.

Epitelial-mesenchymal övergång i metastaserande CRC med missense eller null Trp53

I de enskilda lymfkörtelmetastaserande avlagringar som hittades i var och en av fem olika AKP270/fl-möss, fyra lesioner uppvisade måttligt differentierade adenokarcinom och en lesion var dåligt differentierad (Fig. 3a, b, översta panelerna). Alla måttligt differentierade lymfkörtelmetastaserade lesioner hade stark nukleär β-cateninfärgning samt stark membranfärgning för E-cadherin och frånvarande vimentinfärgning (Fig. 3a), vilket tyder på att epitelegenskaperna bibehålls i AKP270/fl-metastaserade celler som behöll måttligt differentierade egenskaper. I den ena AKP270/fl-mus där lymfkörtelmetastasen hade svagt differentierade egenskaper hittades adenokarcinomlesioner med svagt differentierad morfologi även i lungan, levern och cecum (fig. 3b och kompletterande fig. 1). Den dåligt differentierade cecumlesionen och de metastatiska lesionerna uppvisade stark nukleär β-cateninfärgning och förlust av E-cadherinuttryck och starkt vimentinuttryck, vilket stämmer överens med epitelial-mesenkymal övergång (EMT)-egenskaper (Fig. 3b och kompletterande Fig. 1). Alla metastatiska lesioner i AKP270/fl-möss färgade positivt för CDX2 (kompletterande fig. 2), vilket överensstämmer med deras kolonepiteliska ursprung.

Metastatiska tumörer som härstammar från kolon med missense Trp53-mutationer kan genomgå epitelial-mesenkymal övergång (EMT). Fotomikrografer av H&E-färgade snitt som visar lymfkörtel- och lungmetastaser som hittats i två representativa AKP270/fl-möss (a, b, översta panelerna). Immunohistokemiska färgningar som visar starkt kärnuttryck av β-catenin, starkt membranuttryck av E-cadherin och avsaknad av vimentinuttryck för de måttligt differentierade lesioner som hittades hos en representativ mus (a, de tre nedersta panelerna). Däremot visar de dåligt differentierade lesioner som hittades i en annan mus (b) starkt kärnuttryck av β-catenin, förlust av E-cadherinuttryck och starkt uttryck av vimentin, vilket tyder på att de metastatiska lesioner som hittades i denna mus har genomgått EMT (b, de tre nedersta panelerna). De representativa fotomikrograferna av H&E-färgade sektioner visades med låg förstoring för orientering; de seriella sektionerna genomgick immunohistokemisk färgning och det boxade området med färgningar för β-catenin, E-cadherin och vimentin visades med hög förstoring. Skalstreck: 20 μm för alla bilder

Två av de tre lymfkörtelmetastaserna från tumörbärande AKPfl/fl-möss var måttligt differentierade och en var dåligt differentierad (fig. 4a, b, översta panelerna). AKPfl/fl-musen med levermetastaser hade en måttligt differentierad lymfkörtelmetastasering. I denna mus med levermetastaser visade det presumtiva index kolon primära adenokarcinomet samt de lymfkörtel- och levermetastaserande lesionerna alla ett starkt kärnuttryck av β-catenin och ett starkt membranuttryck av E-cadherin (kompletterande fig. 3). I den enda AKPfl/fl-musen med en dåligt differentierad lymfkörtelmetastasering hittades flera lesioner med liknande morfologi även i dess lunga (fig. 4b). Immunohistokemiska studier visade att de lungmetastatiska lesionerna och det presumtiva index primära adenokarcinomet i cecum alla hade ett starkt nukleärt uttryck av β-catenin och minskat uttryck av E-cadherin och ett starkt uttryck av vimentin, vilket stämmer överens med EMT i den primära cancern och de metastatiska cellerna (fig. 4b). De metastatiska lesionerna i AKPfl/fl-möss var alla CDX2-positiva (kompletterande figur 4). Sammantaget tyder våra data på att det inte finns någon signifikant skillnad i de histologiska egenskaperna hos metastatiska lesioner från AKP270/fl-möss eller AKPfl/fl-möss, och den dåligt differentierade undergruppen av primärtumörer och metastatiska lesioner med Trp53-mutationer med missense- eller nollmutationer kan uppvisa EMT-egenskaper.

Metastatiska tumörer som härstammar från kolonier med null Trp53-mutationer kan genomgå epitelial-mesenkymal övergång (EMT). a Fotomikrograf av ett H&E-färgat snitt som visar en måttligt differentierad tumörlesion som hittades i lymfkörteln hos en representativ AKPfl/fl-mus 2,5 månader efter TAM-injektion (övre panelen). Immunohistokemiska färgningar för denna lesion visar ett starkt kärnuttryck av β-catenin, ett starkt membranuttryck av E-cadherin och avsaknad av vimentinuttryck (de tre nedersta panelerna). b Fotomikrografer av H&E-färgade sektioner som visar de dåligt differentierade lesioner som hittades i cecum, lymfkörteln och lungan hos en annan AKPfl/fl-mus 4 månader efter TAM-injektion (översta panelen). Alla dessa lesioner visar starkt nukleärt uttryck av β-catenin, förlust av E-cadherin-uttryck och starkt uttryck av vimentin, vilket tyder på att de primära och metastatiska lesionerna som hittades i den här musen har genomgått EMT (nedre tre paneler). De representativa fotomikrograferna av H&E-färgade sektioner visades med låg förstoring för orientering; de seriella sektionerna genomgick immunohistokemisk färgning och det boxade området med färgningar för β-catenin, E-cadherin och vimentin visades med hög förstoring. Skala: Stålsvarv: 20 μm för alla bilder

Stabilisering av missense mutant p53-protein är associerad med förlust av vildtyp p53 och sjukdomsprogression

Majoriteten av humana tumörer med missense TP53-mutationer har rapporterats uppvisa TP53-förlust av heterozygotitet (LOH) , och en studie indikerade att TP53 LOH är en förutsättning för missense mutant p53-stabilisering både i sarkomer från möss och i bröstcarcinom . Vi utvärderade p53-färgningsmönster i olika stadier av tumörutvecklingen hos AKP270/+-möss efter induktion av tumörigenes genom TAM-injektion, eftersom det Cre-målinriktade kolonepitelet i AKP270/+-möss initialt har en funktionell Trp53-allel. I hyperplastiska polyper hos AKP270/+-möss, där Kras är aktiverad och Apc LOH ännu inte hade inträffat, är p53-färgningen icke-detekterbar (fig. 5b, panel HP), i likhet med den negativa färgning för p53 som ses i epitelet hos vildtypmöss (fig. 5a), trots att det missense-muterade proteinet p53 R270H missense-muterade proteinet uttrycks konstitutionellt i tjocktarmsvävnad hos AKP270/+-möss. Viss p53-immunoreaktivitet sågs tydligt i adenom (fig. 5b, panel adenom och tabell 3, n = 185) och karcinom (fig. 5c och tabell 3, n = 28) som uppkom hos AKP270/+-möss. Bland dessa tumörer uppvisade 94 % av adenomerna och 43 % av karcinomerna svag p53-färgning (fig. 5 och tabell 3, 5-10 % positivitet), medan 6 % av adenomerna och 57 % av karcinomerna uppvisade stark p53-färgning (fig. 5 och tabell 3, >10 % positivitet, P < 0,0001). Majoriteten av tumörerna med stark p53-färgning uppvisade p53 LOH, medan tumörerna med svag p53-färgning fortfarande behöll Trp53-allelen av vildtyp (fig. 6). Våra resultat liknar de resultat som vi sett i nyligen utförda arbeten om p53 missense-proteinuttryck i sarkomer och bröstkarcinom hos möss . Våra data visar att i likhet med situationen vid tumörutveckling i humant kolon, är uttrycket av ett stabiliserat missense-muterat p53-protein nära korrelerat med förlust av p53-funktionen av vildtyp och progression till invasion.

Stabiliseringen av det muterade p53R270H-proteinet under tumörprogressionen från hyperplasi till karcinom hos AKP270/+-möss. Immunohistokemisk färgning av p53 i en representativ hyperplastisk polyp (HP, b, vänster panel), ett adenom (b, höger panel) och tre karcinom (c) som uppstod i cecum hos AKP270/+-möss. Ett snitt från cecum från en vildtypmus användes som kontroll (a). Färgningen av p53 varierar från icke-detekterbar färgning i de normala (a) och HP (b) sektionerna, till svag färgning (<10% positivitet) i adenom (b) och karcinom 1(c, vänstra panelen), och till stark färgning i karcinom 2 och 3 (>10% positivitet). De streckade linjerna anger muscularis mucosae. Svarta pilar anger invasiva körtlar med svag p53-färgning; röda pilar anger invasiva körtlar med stark p53-färgning. Skalstreck: Tabell 3 Tumörutveckling från adenom till karcinom är förknippad med stabilisering av p53R270H-mutanten i AKP270/+-möss

Stabiliseringen av p53R270H missense mutant korrelerar med p53 loss-of-heterozygosity (LOH). a Genotypning av kolontumörer (T2-T6) som uppkommer i AKP270/+ möss 5 månader efter TAM-induktion. En tumör som uppstått i en AKP270/fl-mus (T1) och tjocktarmsvävnad från en vildtypmus (N) används som positiv respektive negativ kontroll. Förekomsten av Trp53-allelen av vildtyp och rekombinerad Trp53-mutantallel (flox out) påvisades genom PCR. b-e Immunohistokemisk färgning av p53 i tjocktarmsvävnader som beskrivs i (a) visar en stark korrelation mellan stabilisering av mutant p53 (d, T2 och T3) och p53-förlust av heterozygotitet, jämfört med den svaga p53-färgningen och närvaron av Trp53-allelen av vildtyp i tumörer 4-6 (e). De streckade linjerna anger muscularis mucosae. Skala: 100 μm

Global genuttrycksprofilering avslöjar få skillnader mellan mus- eller humantumörceller i tjocktarmen som bär på R270H/R273H missense mutant och noll Trp53/TP53-alleler

Vi har profilerat genuttrycket i vävnader från kolonadenokarcinom från AKP270/fl-möss (n = 6) eller AKPfl/fl-möss (n = 6), med Affymetrix Mouse ST 2.1 Arrays med 24 562 probe-sets. Vi isolerade RNA efter laser capture microdissection (LCM) av cancerceller från en invasiv primärtumör från varje mus. Som kontroller inkluderades mikrodissekerade normala kolonepitelceller från vildtypmöss (n = 3). Vi anpassade ANOVA-modeller till dessa 15 prover med termer för 3 medelvärden. Jämförelser av tumörvävnader med normala vävnader gav över 2400 probe-sets med P < 0,001 för både AKP270/fl- och AKPfl/fl-tumörer, men jämförelser av de två tumörtyperna med varandra gav endast 30 probe-sets, där vi förväntar oss 24,6 probe-sets (24 562*0,001) enbart av en slump. Det sistnämnda resultatet tyder på att de flesta av de 30 probe-sets som hittades är falskt positiva (tabell 4, övre delen), och det fanns få eller inga signifikanta observerbara skillnader i genuttryck mellan tjocktarmstumörer med Trp53 missense-mutationer och de med Trp53 noll-mutationer. I överensstämmelse med denna föreställning fann vi att AKP270/fl- och AKPfl/fl-adenokarcinom inte kunde särskiljas i PC-analyser (Principal Component) av genuttryck, även om båda grupperna av tumörer har genuttrycksmönster som tydligt skiljer sig från kolonepitel av vildtyp (Supplementary Fig. 5).

Vi utförde också Affymetrix-genuttrycksanalyser på organoider som härstammade från tjocktarmstumörer som uppkom hos AKP270/fl-möss (n = 3) eller AKPfl/fl-möss (n = 2). Organoider som härrörde från adenom hos Apcfl/fl-möss (Cont 1, n = 3) eller från kolonepitel av vildtyp (Cont 2, n = 4) användes som kontroller. Vi anpassade en ANOVA-modell till de fyra grupperna av organoider. Vi fann 435 probe-sets med P < 0,001 för AKPfl/fl-organoider och 609 probe-sets för AKP270/fl-organoider, jämfört med Apc-null-organoider (Cont 1, tabell 4). Dessutom identifierades fler differentiellt uttryckta probe-sets (960 för AKPfl/fl och 1332 för AKP270/fl, P < 0,001) när AKPfl/fl- eller AKP270/fl-organoider jämfördes med normala kolonorganoider (Cont2, tabell 4). Vi utförde bananberikningstest på gener som var differentiellt uttryckta i både AKPfl/fl- och AKP270/fl-tumörer och organoider jämfört med normalt kolonepitel. Vi fann att en mängd olika vägar var signifikant förändrade i både p53-noll- och missense-muterade tumördrivna celler, med gener som är involverade i G2M-kontrollpunkt, celltillväxt, stressrespons och cellmetabolism som de mest signifikant förändrade genuppsättningarna (Kompletterande tabell 2). Vi fick dock endast 35 probe-sets med P < 0,001 för AKPfl/fl vs. AKP270/fl-jämförelsen (tabell 4), där återigen 24,6 förväntades av slumpen, vilket visar att det var svårt att hitta genuttrycksskillnader mellan organoiderna med noll- och missense Trp53-mutationer. PC-plottar visade att AKPfl/fl- och AKP270/fl-proverna alltid klustrade tillsammans och skiljdes från organoider som härrörde från Apc-muterade adenom (Cont1, kompletterande fig. 6) eller normalt kolonepitel (Cont2, kompletterande fig. 6).

För att testa om det fanns påvisbara skillnader i genuttrycksmönster mellan mänskliga CRC med missense och noll TP53-mutationer analyserade vi log2-transformerade normaliserade räkningar från RNA-seq-data för CRC i The Cancer Genome Atlas (TCGA) , Vi jämförde 9 tumörer med missense-mutationer i TP53-kodon 273 med 36 tumörer med noll-mutationer (orsakade av ramförskjutning, splice site- och nonsense-mutationer, se tilläggstabell 3 för detaljer) med hjälp av ett T-test med två stickprov för 20531 gener. Vi hittade bara 244 gener med P < 0,01 och 30 gener med P < 0,001, vilket bara var något fler än det antal som förväntades av slumpen (205 respektive 20,5, tabell 4). TP53 i sig gav den mest signifikanta skillnaden i genuttryck och var i genomsnitt nästan 5 gånger lägre i tumörer med nollmutationer jämfört med TP53 kodon 273-mutationer (kompletterande tabell 4, P = 2 × 10-10). Återigen fann vi liten separation av de två uppsättningarna tumörer i PC-analysen (kompletterande figur 7). I överensstämmelse med den liknande transkriptionella signaturen anpassade vi Cox proportional hazard-modeller till 43 patienter med överlevnadsdata, där vi använde ålder, stadium och TP53-status i modellen, och fann inget signifikant samband mellan patientutfallet och TP53-mutationsstatus (R273 missense-mutation vs. noll-mutation, tilläggstabell 5, P = 0,67 med Wald-test). Det är värt att nämna att med endast 7 dödsfall bland dessa patienter var kraften för att upptäcka skillnader ganska låg. Slutligen tittade vi på korsningen av gener som gav P < 0,05 i något av de tre dataset som beskrivits ovan (dvs. mänskliga och mus-kolon-tumörer, mus-kolon-organoider) som förändrades i samma riktning för Trp53/TP53 missense vs. noll-jämförelse. I kompletterande tabell 4 visar vi gener som gav P < 0,05 och fold-förändringar på minst 1,3 i två av de tre datamängderna. Vi hittade endast Trp53/TP53 som förändrades i samma riktning i alla tre studierna (Kompletterande tabell 4; den detaljerade statistiken för varje gen i alla tre datamängderna finns tillgänglig i vår offentliga GEO-serie). Sammantaget visar våra genuttrycksanalyser för CRC hos mus och människa att tjocktarmstumörer med R270/R273 missense eller noll Trp53/TP53-mutationer har mycket likartade genuttrycksprofiler, vilket stämmer överens med frånvaron av några större skillnader i biologiska egenskaper i tjocktarmstumörerna och fenotyper som uppstår in vivo i AKP270/fl- och AKPfl/fl-möss.