Oxidativ-fermentativ-testet (OF-testet) utvecklades av Hugh och Leifson 1953. De utvecklade OF-medier för att skilja mellan oxidativa bakterier (som producerar syra från kolhydrater endast under aeroba förhållanden) och fermentativa bakterier (som producerar syra både under aeroba och anaeroba förhållanden).
Sackarolytiska mikroorganismer bryter ner glukos antingen fermentativt eller oxidativt. Slutprodukterna av fermenteringen är relativt starka blandade syror som kan detekteras i ett konventionellt testmedium för fermentering. De syror som bildas vid oxidativ nedbrytning av glukos är dock extremt svaga och mindre, och det krävs ett känsligare oxidationsfermenteringsmedium enligt Hugh och Leifsons OF-medium för detektion. Mediet tillverkades genom att öka mängden glukos utöver den som finns i medium som används för att upptäcka jäsning och genom att minska mängden pepton.
Hugh och Leifsons OF-medium skiljer sig från kolhydratfermenteringsmedier på följande sätt:
- Koncentrationen av agar minskas från 3 % till 2 %, vilket gör den halvfast i konsistensen (detta underlättar bestämningen av organismens motilitet).
- Koncentrationen av pepton minskas från 11 % till 2 %. (Minskar mängden alkaliska produkter som produceras av peptonets metabolism; vilket minskar den neutraliserande effekten av dessa produkter).
- Kolhydratkoncentrationen ökas med 0,5 % till 1.0 % (Den ökade koncentrationen av glukos i mediet ökar produktionen av dessa svaga syror till en nivå som kan detekteras med bromthymolblåindikatorn.)
Princip:
Det oxidativt-fermentativa testet fastställer om vissa gramnegativa stavar metaboliserar glukos genom fermentation eller aerob respiration (oxidativt). Under den anaeroba fermentationsprocessen omvandlas pyruvat till en mängd olika blandade syror beroende på fermentationstyp. Den höga koncentrationen av syra som produceras under jäsningen gör att bromthymolblåindikatorn i OF-media ändras från grönt till gult i närvaro eller frånvaro av syre .
Vissa icke-fermenterande gramnegativa bakterier metaboliserar glukos med hjälp av aerob respiration och producerar därför endast en liten mängd svaga syror under glykolysen och Krebscykeln. Den minskade mängden pepton och den ökade mängden glukos gör det lättare att upptäcka de svaga syror som produceras. Dikaliumfosfatbuffert tillsätts för att ytterligare främja syredetektion.
Användningsområden:
OF-testet används för att avgöra om gramnegativa bakterier metaboliserar kolhydrater oxidativt, genom fermentering, eller om de är nonsakkrolytiska (har ingen förmåga att använda kolhydrater i media).
Media:
Hugh och Leifsons OF basalmedium; beståndsdelarna är följande:
- Natriumklorid : 5,0 g
- Di-kaliumfosfat : 0,3 g
- Pepton : 2.0 g
- Bromthymolblått:0,03 g
- Agar: 3,0 g
- Glukos : 10 g
- Vatten : 1000 ml
Ph-värdet bör justeras till 7,1 före autoklavering. Efter att mediet autoklaverats vid 121 °C i 15 minuter tillsätts en filtersteriliserad lösning av 10 % kolhydratlösning aseptiskt till mediet till en slutkoncentration på 1 %.
Förfarande
- Inokulera två rör med OF-testmedium med testorganismen med hjälp av en rak tråd genom att sticka ”halvt i botten” på röret.
- Täck det ena röret i varje par med ett 1 cm tjockt lager steril mineralolja eller flytande paraffin (det skapar anaeroba förhållanden i röret genom att förhindra diffusion av syre) och lämna det andra röret öppet för luft.
- Inkubera båda rören vid 35°C i 48 timmar (långsamt växande bakterier kan ta 3-4 dagar innan resultat kan observeras)
Tolkning
Syraproduktion påvisas i mediet genom att en gul färg uppstår. När det gäller oxidativa organismer kan färgproduktionen först noteras nära mediets yta.
Följande är reaktionsmönstren:
- Fermentationsresultat: Syraproduktion i båda rören (öppna och täckta). Den producerade syran ändrar pH-indikatorn, bromthymolblått, från grönt till gult. t.ex. Escherichia coli
- Oxidativt resultat: Syraproduktion i det öppna röret (aerobt) och inte i det oljetäckta röret (anaerobt) indikerar ett oxidativt resultat. Icke-fermenterande bakterier som metaboliserar glukos via oxidativ metabolism ger ett oxidativt resultat. t.ex. Pseudomonas aeruginosa
- Icke-sackarolytisk (negativt OF-resultat): Icke-sackrolytiska bakterier ger ett negativt OF-resultat. Det negativa resultatet indikeras av ingen färgförändring i det oljetäckta röret och i vissa fall en ökning av pH (pH 7,6) som ändrar bromthymolblåttet från grönt till blått i den övre delen av det öppna röret. Ökningen av pH beror på aminproduktion av bakterier som bryter ner pepton (protein) i mediet.
Till exempel Alcaligenes faecalis.
Kvalitetskontroll
- Glukosjäsning: Escherichia coli
- Glukosoxidator: Pseudomonas aeruginosa
- Nonsackarolytisk: Moraxella species
Lämna ett svar