I HC-FIA-systemet förstärker DNA-funktionaliserade FNP:er för sonden signalen från hybridiseringen av viralt RNA och DNA:t i sonden. Konstruktionsprincipen för HC-FIA-biosensorn visas i fig. 1.
a, Principen för HC-FIA. b, Representativa resultat på en lateralflödesremsa. c, Anordningen för fluorescensanalys. d, Ett fotografi av det bärbara koffertlaboratoriet, som har en längd på 55,5 cm, en bredd på 37 cm och en höjd på 23 cm, med en vikt på 8,5 kg. e, Testprocessen för HC-FIA-analysen. Steg 1: hybridisering av nukleinsyra i en inkubator vid konstant temperatur. Steg 2: Bestämning av intensiteten hos fluorescenssignalerna på testkortet med hjälp av den anordning som visas i c. f, Provfördelning i arvsmassan hos SARS-CoV-2.
Design och funktionssätt för HC-FIA-assayet
Murin S9.6 monoklonala antikroppar är prefixerade på testlinjen (T) på lateralflödesremsan, och kontrolllinjen (C) är belagd med polyklonala antikroppar av get anti-kanin-IgG (fig. 1a). FNP märkta med S9.6-antikroppar och kanin-IgG placeras i reaktionsröret. I början av detektionsprocessen lyseras och frigörs SARS-CoV-2 i provet från svalgsvabben eller sputumprovet, och det frigjorda RNA hybridiseras med den specifika SARS-CoV-2-DNA-sonden. Den resulterande RNA-DNA-hybriden fångas upp av FNP-märkta S9.6-antikroppar, och komplexet flyter längs provplattan och nitrocellulosemembranet mot det absorberande pappret under kapillära krafter. När komplexet passerar genom T-området fångas det upp av S9.6-antikropparna och genererar gradvis en fluorescerande signal. I C-området fångas FNP-märkt kanin-IgG av antikanin-IgG. Förekomsten eller frånvaron av SARS-CoV-2 RNA som mål är baserat på ett gränsvärde för fluorescensintensiteten (fig. 1b, c). Figur 1d visar ett bärbart koffertlaboratorium som har förmågan att ge kvalitativa resultat på mindre än en timme efter följande två steg: hybridisering och immunofluorescensanalys (Fig. 1e).
Här använde vi förhållandet mellan testfluorescenssignalen och kontrollfluorescenssignalen (T/C) på sidoflödesremsan på ett sådant sätt att påverkan av eventuell bakgrundsfluorescens från testkortet minimerades. Genom att mäta T/C-förhållandet i svalgprov från 211 friska individer fann vi att det genomsnittliga bakgrunds-T/C-förhållandet var 49,95, med ett s.d. på 17,16 (kompletterande figur 1a). ROC-kurvan (receiver operating characteristic) och arean under kurvan (AUC) användes för att bestämma gränsvärdet och bedöma den diagnostiska noggrannheten hos HC-FIA-analysen på grundval av sensitivitet och specificitet vid olika tröskelvärden. Vi fastställde en ROC-kurva med en AUC på 0,999 med ett 95-procentigt konfidensintervall (CI) på 0,997-1,000 (kompletterande figur 1b) med hjälp av svabbprover från halsen från 100 kliniskt bekräftade och uteslutna COVID-19-fall. Det gränsvärde som gav högst sensitivitet och specificitet fastställdes till 102,07, vilket motsvarar Youden-indexpunkten 0,980. Alternativt används vanligtvis ett tröskelvärde på två gånger det negativa bakgrundsvärdet (här 49,95 × 2 = 99,90) som gränsvärde i immunoassays. För enkelhetens skull valde vi ett T/C-gränsvärde på 100,00.
HC-FIA-analysutveckling
Optimering av DNA-prober för mål-RNA-sekvensen av SARS-CoV-2 är nyckeln till att förbättra analysens effektivitet. En förteckning över alla DNA-sondsekvenser som vi utformade finns i kompletterande tabell 1. Genomet för SARS-CoV-2 består av cirka 30 000 baser, inklusive ett varierande antal (6-11) öppna läsramar (ORF). Den första ORF:n utgör cirka 67 % av hela genomet och kodar för 16 icke-strukturella proteiner samt hjälpproteiner och strukturella proteiner. De fyra viktigaste strukturproteinerna är spikglykoproteinet (S), det lilla höljeproteinet (E), matrisproteinet (M) och nukleokapsidproteinet (N)15,16. De flesta nukleinsyradetektionstest för SARS-CoV-2 använder följande tre bevarade regioner i virusgenomet: ORF1ab, där genen för RNA-beroende polymeras (rdrp) är belägen15 , och de regioner som kodar för N och E.
Vi började med att hämta RNA-genomsekvensen för SARS-CoV-2 från National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank (accessionsnummer MN908947, MN908947.3, MN908947.2 och NC_045512.1). En detaljerad analys av andra publicerade sekvenser för SARS-CoV-2-genomet visade ingen anmärkningsvärd variation i dessa regioner. Med hjälp av programvaran Primer Premier 5.0 utformade vi tre prober för var och en av de tre regionerna: CoV01 och CoV04, som ligger i den rekommenderade regionen för upptäckt av ORF1ab respektive N, och CoV08, som ligger i samma region som E17. Genompositionerna för sondens bindningsställen i referensgenomsekvensen (NC_045512.2) anges i fig. 1f.
Sekvensanpassning genomfördes mellan de designade DNA-sonderna och sekvenser från det mänskliga genomet och från genomen av virus, bakterier, mykoplasma, klamydia och andra vanliga patogener. Proberna matchade endast den genomiska sekvensen av SARS-CoV-2, och vi fann ingen homologi med humant genomiskt DNA. Pseudovirus som bär på olika regioner av målgenen och som konstruerats med lentivirus som vektorer användes som positiva kontroller. Målgensekvenserna för de pseudovirus som användes visas i kompletterande tabell 2. P1 var positiv för SARS-CoV-2 N-regionen, P2 för SARS-CoV-2 E-regionen och P3 för SARS-CoV-2 ORF1ab-regionen. Koncentrationen av de tre positiva kontrollerna var 3 000 transduktionsenheter (TU) ml-1, vilket innebär att det fanns 3 000 infektiösa viruspartiklar per ml. Fysiologisk saltlösning, renat vatten och svabbprover från svalget som var positiva för andra vanliga patogener användes som negativa kontroller av N1-N17. En förteckning över information om de positiva och negativa referenser som användes i studien finns i kompletterande tabell 3. Testresultaten visas i de kompletterande tabellerna 4-6. För ORF1ab-regionen valdes proberna CoV01 och CoV03, för E-regionen valdes proben CoV08 och för N-regionen föredrog proberna CoV04 och CoV06 att binda till mål-RNA. De utvalda DNA-proberna optimerades ytterligare genom kombination (kompletterande tabell 7), där varje grupp av prober samtidigt riktade sig mot alla tre segmenten. HC-FIA-testresultaten i kompletterande tabell 8 visar att kombinationen av proberna Cov01, Cov04 och Cov08 (grupp 2) diskriminerade mellan alla positiva kontrollprover och de negativa kontrollerna och detekterade positiva prover med en låg virustiter (1 000 TU ml-1; kompletterande tabell 3, L1-L3) med en positiv frekvens på mer än 95 %. Grupp 2 valdes därför som den slutliga kombinationen. Hittills har 13 411 SARS-CoV-2-nukleotidsekvenser publicerats på NCBI. En justering av de tre proberna med motsvarande målregion i de 13 411 uppladdade sekvenserna visade att probernas målregioner var tillräckligt bevarade för att ge 100 % likhet.
Vi optimerade också testförhållandena för assayet, särskilt inkubationstiden för hybridisering och avläsningstiden för testremsan. Assayprestanda för inkubationstiderna 10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min och 60 min vid 56 °C visas i kompletterande tabell 9. Observera att 20 minuter var tillräckligt för att DNA-sonderna skulle hybridisera med målregionen, vilket avspeglades av den 100 % positiva andelen vid detektering av positiva prover från halssvabbar och sputumprover med låg virustiter (1 000 TU ml-1; kompletterande tabell 3, L1-L3). När inkubationstiden förlängdes till 50 eller 60 minuter var reaktionen inte lika stabil, eftersom den positiva frekvensen för L1-L3-referensproverna minskade. Med hänsyn till detektionseffektiviteten och kravet på virusinaktivering valde vi 30 min som inkubationstid för hybridisering vid 56 °C. Vi bedömde också avläsningstiden för remsan för värdena 10 min, 12 min, 15 min och 18 min (kompletterande tabell 10). Resultaten visade att 12 min eller längre ledde till korrekt detektion av de positiva och negativa referensproverna. Variationskoefficienten (CV) var dock lägre än 10 % för detektering av positiva prover med låg viraltiter endast när man använde en avläsningstid på 15 minuter. Vi valde därför en avläsningstid på 15 min.
Guanidiniumtiocyanat och guanidinklorid – de mest använda proteindenatureringsmedlen för extraktion av nukleinsyror – jämfördes som transportmedier för provkonservering. Guanidiniumtiocyanat ledde till bättre prestanda när det gäller att skilja mellan positiva och negativa prover, med ett relativt lågt CV för prover med en låg viral titer. Guanidiniumtiocyanat i en koncentration så hög som 6 mol l-1 har faktiskt visat utmärkta antivirala egenskaper18. Vi valde guanidiniumtiocyanat i en koncentration på 5 mol l-1 som proteindenatureringsmedel för viral inaktivering i transportmedium.
Specificitet hos HC-FIA-assayet
Efter att ha optimerat sondsekvenserna och reaktionsförhållandena undersökte vi specificiteten hos HC-FIA-assayet för att detektera SARS-CoV-2. De positiva kontrollerna omfattade pseudovirus (proverna P1-P3) med målgener och fem kliniska svabbprover från halsen (proverna P4-P8), bekräftade med hjälp av ett RT-qPCR-baserat nukleinsyradetektionskit (Shanghai ZJ Bio-Tech). De negativa kontrollerna, som bestod av svabbprover från halsen, bekräftades vara negativa för SARS-CoV-2 och positiva för influensa A, influensa B, respiratoriskt syncytialvirus, chlamydia pneumoniae, adenovirus eller andra patogener (proverna N5-N17), eller pseudovirus-positiva för N-regionen av MERS (prov N18) eller SARS (prov N19). En förteckning över alla prover finns i kompletterande tabell 3. En förteckning över detektionsresultaten för 8 positiva referensprover och 15 negativa referensprover finns i kompletterande tabell 11.
Vi undersökte om det fanns korsreaktivitet mellan SARS-CoV-2 och 55 vanliga patogener som orsakar luftvägssjukdomar. Källa och kvantitativ information om varje patogen mikroorganism finns i Supplementary Dataset 1. Den ursprungliga virustitern bestämdes till 106 plackbildande enheter per ml med hjälp av en plackanalys. För interferensprover av bakterier, mykoplasma och klamydia var koncentrationsnivån 107 kolonibildande enheter per ml. Dessutom extraherades och kvantifierades humant genomiskt DNA till 90-105 µg ml-1 från tre helblodsprover. HC-FIA-analysen uppvisade utmärkt specificitet för SARS-CoV-2, utan någon uppenbar korsreaktivitet med alla andra patogenprover och humant genomiskt DNA (Supplementary Dataset 1).
Då den monoklonala antikroppen S9.6 också binder till RNA-RNA-duplexer19 , särskilt AU-rika sådana20 , utformade vi dubbelsträngade RNA-sekvenser med varierande andelar AU. Detaljerad sekvensinformation finns i kompletterande tabell 12. Som framgår av kompletterande tabell 13 uppvisade HC-FIA-analysen, oavsett AU-halt, ingen påvisbar positiv signal mot dubbelsträngat RNA, vilket tyder på att det finns en låg bindningsaffinitet mellan S9.6-antikroppen och dubbelsträngat RNA under analysförhållandena. Vi undersökte också om närvaron av dubbelsträngat RNA påverkar testets prestanda vid detektion av kliniska svabbprover från halsen eller sputumprover. Vi använde 2 positiva svabbprover från halsen, 2 positiva sputumprover, 10 negativa svabbprover från halsen och 5 negativa sputumprover. Vi mätte T/C-förhållandena i förhållande till T/C-värdena för det interferensfria testet och fann att förhållandena varierade mellan 0,9 och 1,1 (kompletterande dataset 1). Detta tyder på att närvaron av dubbelsträngat RNA, oavsett AU-innehåll, inte påverkar HC-FIA-analysens prestanda nämnvärt.
Känslighet och precision för HC-FIA-analysen
Vi spädde pseudovirusproverna som innehöll tre sektioner av målgenerna seriemässigt till titrar på 5000, 2500, 1000, 800, 500, 250 och 100 TU ml-1, och beräknade de genomsnittliga T/C-värdena för 20 parallella tester. Figur 2a visar att detektionsgränsen (LOD) för pseudovirus som är positiva för N-, E- eller ORF1ab-regionerna i SARS-CoV-2 var så låg som 1 000 TU ml-1, med en positiv andel på mer än 95 %. När titern av pseudovirusproverna nådde 108 TU ml-1 observerades ingen anmärkningsvärd krokverkan (kompletterande figur 2). Testets linjära område motsvarar titrar mellan 103 och 106 eller 107 TU ml-1.
De vertikala axlarna visar förhållandet mellan fluorescensintensitet (T/C) för testsignalen (T) och kontrollsignalen (C). För varje koncentration utfördes 20 tester parallellt. LOD fastställdes som den koncentration vid vilken den positiva andelen var större än eller lika med 95 %. a, T/C-förhållanden för seriellt utspädda pseudovirusprover som är positiva för N-, E- och ORF1ab-regionerna av SARS-CoV-2. b, T/C-förhållanden för seriellt utspädda prover från svabbprover i halsen från tre kritiskt sjuka patienter. Data är medelvärde ± s.d.
Halsvabbprover från tre kritiskt sjuka patienter – som bestämdes vara positiva för SARS-CoV-2 med hjälp av RT-qPCR, och virusbelastningen kvantifierades med hjälp av digital PCR – blandades med negativa halssvabbprover för att bereda serieutspädningar på 2 000, 1 000, 500, 400 och 250 kopior per ml. Som framgår av figur 2b var LOD 500 kopior per ml med en positiv andel på mer än 95 %. Kliniska svalgprov med T/C-värden nära det kritiska värdet (100) för positivitet (prover med 512, 489 och 497 kopior per ml av ORF1ab-regionen, enligt digital PCR) användes för att verifiera LOD (testerna utfördes 20 gånger parallellt). Den positiva andelen för dessa prover var högre än 95 % (kompletterande tabeller 14-16).
För att utvärdera HC-FIA-kitets precision utfördes parallella tester 20 gånger för varje kliniskt svabbprov från halsen under fem på varandra följande dagar. De representativa kliniska prover som valdes ut var ett positivt prov (1 348 kopior per ml av ORF1ab-regionen), ett prov från en kritiskt sjuk individ (kritisk; 512 kopior per ml) och ett negativt prov (0 kopior per ml). De genomsnittliga T/C-värdena för de tre partierna vid detektering av det positiva provet var följande: 199,92 ± 8,25 (CV = 4,13 %), 200,68 ± 7,91 (CV = 3,94 %) respektive 199,03 ± 7,43 (CV = 3,73 %), jämfört med 109,17 ± 5,68 (CV = 4,65 %), 110,80 ± 5,68 (CV = 4,65 %), 110,80 ± 5,80 (CV = 4,65 %) och 199,92 ± 8,25 (CV = 4,13 %).63 (CV = 5,08%) och 111,48 ± 4,67 (CV = 4,19%) för det kritiska provet och med 44,66 ± 3,36 (CV = 7,52%), 43,99 ± 2,72 (CV = 6,18%) och 44,72 ± 2,98 (CV = 6,98).66 %) för det negativa provet. CV-värdena mellan satser var 3,89 %, 4,66 % och 6,74 %. Således visade analysen god precision och reproducerbarhet för detektion av SARS-CoV-2.
Robusthet hos HC-FIA-analysen
För att lära oss mer om HC-FIA:s robusthet utvärderade vi effekterna av endogena interferenssubstanser (t.ex. hemoglobin och mukin) och av exogena interferenssubstanser (i synnerhet kliniska läkemedel som vanligen används vid behandling av patienter med luftvägsinfektioner, inklusive antivirala läkemedel, antibiotika och hormoner). För detta experiment använde vi 18 kliniska svabbprover från halsen, inklusive sex kritiska prover (500-530 kopior per ml för ORF1ab-regionen, enligt digital PCR), sex negativa prover och sex positiva prover. Resultaten registrerades också som förhållandet mellan T/C-värdena (störningsprover jämfört med kontrollprover). I de förberedda interferensproverna var hemoglobinkoncentrationerna 0,5 g l-1, 1,0 g l-1 och 2,0 g l-1, och koncentrationerna för mucin var 5 g l-1, 10 g l-1 och 20 g l-1. Läkemedelskoncentrationerna i de exogena interferensproverna (kompletterande tabeller 17-19) var mycket högre än deras högsta plasmakoncentrationer in vivo. Som förväntat låg alla T/C-förhållanden i intervallet 0,9-1,1 (kompletterande dataset 2), vilket tyder på att HC-FIA-analysen är robust mot interferens.
Klinisk utvärdering av HC-FIA-testutrustningen
För att ytterligare utvärdera HC-FIA-testets prestanda genomfördes en randomiserad dubbelblind klinisk prövning genom att jämföra testet med RT-qPCR (SARS-CoV-2-detekteringskit tillverkat av Shanghai ZJ Bio-Tech och godkänt av NMPA) eller med kliniska diagnostiska resultat vid tre oberoende medicinska institutioner. HC-FIA-testutrustningen som användes i den kliniska utvärderingen innehöll testkort, lysisbuffert, provkonserveringslösning, positiva och negativa kontroller samt ett reaktionsrör med DNA-sonder och märkta antikroppar. De kliniska diagnosresultaten för bekräftade eller uteslutna COVID-19-fall, som tillhandahölls av de utsedda sjukhusen, baserades på datortomografiska bilder och på patienternas kliniska manifestationer, i enlighet med riktlinjerna i ”Diagnosis and Treatment Protocol for Novel Coronavirus Pneumonia (Trial Version 6.0)” i Kina. Totalt 734 prover (593 svabbprover från halsen och 141 sputum) från 670 personer testades parallellt. Rådata från de kliniska försöken finns som kompletterande dataset 3. Det RT-qPCR-detektionskit som vi använde var utformat som ett system med tre mål (ORF, N och E), och vi följde test-retest-principen för att skilja mellan positiva och negativa prover. Förutom fyra misslyckade tester som orsakades av en ogiltig intern standard genomfördes åtta omtestningar: en för att endast en rdrp-målgen var positiv och sju för att endast N- och E-generna var positiva. I dessa fall exkluderades de tidigare negativa resultaten.
Av de 670 patienter som deltog i studien var 313 män (46,72 %) och 357 kvinnor (53,28 %). Som framgår av kompletterande figur 3 liknar åldersfördelningen i den inskrivna populationen åldersfördelningen för SARS-CoV-2-infektion21. Besöksfrekvensen och diagnosfrekvensen var också balanserade. Resultaten från HC-FIA-testutrustningarna visas i fig. 3, som visar fotografier av typiska resultat under en fluorescerande ljuskälla och motsvarande gradientfärgmatris efter avläsningsnormalisering. Gradientfärgmatrisen i kompletterande fig. 4 visar de normaliserade fluorescensavläsningarna av 734 kliniska prover (kompletterande dataset 3).
Fotografier av typiska resultat under en fluorescerande ljuskälla och motsvarande fluorescensavläsningar som en färggradientmatris, normaliserade till det maximala avläsningsvärdet. Grupp E består endast av COVID-19-negativa resultat. Den horisontella linjen på färgstapeln anger gränsvärdet. En färggradientmatris för fluorescensavläsningarna av 734 kliniska prover finns i kompletterande figur 4 och motsvarande numeriska data i kompletterande dataset 3.
För 621 fall stämde HC-FIA-resultaten och de kliniska diagnoserna överens (210 bekräftade fall och 411 uteslutna fall; tabell 1). 49 fall (27 bekräftade och 22 uteslutna enligt den kliniska diagnosen) stämde inte överens med HC-FIA-resultaten. För 730 prover överensstämde resultaten från HC-FIA-testet med RT-qPCR (249 positiva och 481 negativa; tabell 1). Fyra prover som var negativa på grundval av RT-qPCR var positiva med HC-FIA. Tre av dessa prover kom från patienter som kliniskt diagnostiserats som COVID-19-uteslutna, vilket tyder på att HC-FIA-testet hade gett falskt positiva resultat. Det återstående provet motsvarade ett bekräftat fall genom klinisk diagnos, vilket överensstämde med HC-FIA-testet.
Cohen’s Kappa (κ), som är ett ofta använt mått på tillförlitligheten i överensstämmelsen mellan kategoriska variabler, är ett robustare mått jämfört med enkel procentuell överensstämmelse mellan variablerna, eftersom κ tar hänsyn till överensstämmelser som uppstår av en slump, särskilt i obalanserade dataset. Vi ansåg att ett κ-värde på mer än 0,75 indikerar en hög grad av överensstämmelse (perfekt överensstämmelse motsvarar ett κ = 1). Som framgår av tabell 2 hade resultaten från HC-FIA-testet hög överensstämmelse med klinisk diagnos (κ = 0,8393) och med RT-qPCR (κ > 0,98, oavsett provtyp).
.
Lämna ett svar