Enhetsdefinition
En enhet restriktionsendonukleasaktivitet definieras som den mängd enzym som krävs för att producera en fullständig nedbrytning av 1 µg substrat-DNA (eller fragment) i en total reaktionsvolym på 50 µl på 60 minuter under optimala testförhållanden enligt vad som anges för varje restriktionsendonukleas.
Bestämning av restriktionsendonukleasernas volymaktivitet
Restriktionsendonukleasaktivitetsanalyser utförs genom att tillsätta olika enzymutspädningar till lämplig analysbuffert som innehåller 1 µg substrat-DNA. Efter 60 minuters inkubation vid lämplig temperatur stoppas digestionen och DNA-proverna visualiseras genom agarosgel/ethidiumbromidelektrofores. Den mest utspädda enzymlösningen som ger en fullständig digestion används för att beräkna aktiviteten i enheter/µl.
Bemärk att aktiviteten är substratberoende och när man arbetar med ett nytt substrat bör enzymet titreras för att bestämma den faktiska eller förväntade aktiviteten.
Kvalitetskontroller
Resultaten av alla kvalitetskontrollanalyser rapporteras på det tekniska databladet som medföljer varje enzym.
Overdigestion Assay
En overdigestion assay användes som en kvalitativ bestämning av enzymets renhet och av avsaknad av ospecifika DNaser. I överdigestionsanalysen tillsätts ökande mängder av varje restriktionsendonukleas (vanligtvis 10, 20, 30, 40, 50 enheter) till en serie rör som innehåller 1 µg substrat-DNA. Efter 20 timmars inkubation under de rekommenderade testförhållandena bestäms det maximala antalet enheter som ger ett klart, skarpt, normalt bandningsmönster genom agarosgel/ethidiumbromidelektrofores.
För att klara testet måste enzymet ge ett oförändrat bandningsmönster under förhållanden med upp till 600 gånger överdigestion (enheter x timmar) jämfört med en 2-faldig digest. Om enzymet uppvisar ”stjärnaktivitet” vid ett lägre än 600-faldigt funktionellt överskott, innehåller produktbeskrivningen information om det funktionella överskott vid vilket ”stjärnaktiviteten” inte uppträder.
Test för ospecifika endonukleaser
För att testa ospecifik endonukleaskontaminering inkuberas varje restriktionsendonukleas med ett supercoiled plasmidsubstrat som saknar restriktionsendonukleasets igenkänningssekvens. En enda ospecifik nick i RF I-dna omvandlar det till RF II-formen (nicked circle). Ökande mängder enzym (vanligen 10, 20, 30, 40, 50 enheter) tillsätts till en serie rör som innehåller 1 µg RF I-dna (supercoiled form). Efter en 20-timmars inkubation under de rekommenderade testförhållandena särskiljs de två formerna på agarosgeler och den procentuella omvandlingen från RF I till RF II bestäms.
Ligations- och omskärningsanalys
En ligationsanalys användes för att bestämma DNA:s funktionella renhet efter restriktionsenzymspjälkning. Substrat-DNA smälts fullständigt med ett 10- och 50-faldigt överskott av restriktionsendonukleaset i lämplig testbuffert, ligeras med T4-DNA-ligas och omskärs med samma restriktionsenzym. Skurna, ligerade och omskurna DNA analyseras genom agarosgel/ethidiumbromidelektrofores. Ett normalt bandningsmönster indikerar intakta 5- och 3-terminaler samt frånvaro av kontaminerande nukleaser eller fosfataser.
Stabilitet
Alla Jena Bioscience restriktionsendonukleaser omprövas var 4-6:e månad. Denna process gör det möjligt för oss att säkerställa full enzymaktivitet och optimal prestanda i varje enzym som vi skickar. På grund av de utmärkta resultaten av denna testning har vi förlängt utgångsdatumet för de flesta av våra enzymer till 18 månader.