Radiometriska ligandbindningsanalyser | Applikationsstöd Knowledgebase | Lab Products & Services | PerkinElmer

top

Översikt

Radioaktiva ligander används vanligen för att mäta ligandbindning till receptorer. I den här analysen kommer du att mäta bindningen av en radiomärkt ligand till celler eller cellmembran som innehåller en receptor av intresse. Både hela celler och cellmembran kan användas för denna analys. Radioligander kan användas för att utföra mättnadskurvor, konkurrens- och kinetiska experiment.

Ligand-receptorbindning

När du väljer en radioligand finns det några faktorer som du bör tänka på:

• Hög specifik aktivitet: Radioligander med hög specifik aktivitet är väl lämpade för ligandbindningsanalyser. Specifik aktivitet anger hur mycket radioaktivitet det finns per ligandmolekyl och anges vanligen i enheter av Curies per millimole ligand. Flera av våra 125I-märkta ligander erbjuds med maximal specifik aktivitet (2200 Ci/mmol om en 125I-märkningsplats finns tillgänglig, 4400 Ci/mmol om två 125I-märkningsplatser finns tillgängliga etc.). Detta innebär att praktiskt taget varje ligandmolekyl som tillhandahålls i lagerflaskan är radiomärkt. För tritierade ligander (3H-ligander) bör man helst välja en ligand som har en specifik aktivitet över 20 Ci/mmol. Den högsta teoretiska specifika aktiviteten per tritium är 29 Ci/mmol (Curies per millimole tritium). Specifik aktivitet över detta värde indikerar att varje ligandmolekyl i genomsnitt har minst ett tritium.
• Låg ospecifik bindning: Hydrofoba ligander uppvisar i allmänhet högre icke-specifik bindning. Detta kan ibland kompenseras genom att belägga filter med BSA för att minska den icke-specifika bindningen. Att inkludera BSA, salter eller detergenter i tvätt- eller bindningsbufferten kan också bidra till att minska den icke-specifika bindningen. Om den radiokemiska stamprodukten är förpackad i en silaniserad injektionsflaska (se det tekniska databladet) kan detta tyda på att liganden är något hydrofob
• Hög renhet: Helst bör liganden ha en radiokemisk renhet på över 90 %. Den radiokemiska renheten minskar med tiden, och den faktiska hastigheten för denna nedbrytning accelererar med tiden. Radiokemisk renhet och nedbrytningshastighet för våra olika radiokemikalier finns på de partispecifika tekniska databladen.
• Hög selektivitet: Ju mer selektiv liganden är för din receptor, desto bättre blir dina data. Hög selektivitet innebär att liganden mestadels kommer att kännas igen av endast en receptor av intresse, framför andra receptorer som kan finnas i ett cellmembran. Dessutom kan användning av membran som överuttrycker den aktuella receptorn bidra till att minska eventuella bidrag från receptorer som uttrycks endogent i membranet.
• Stabilitet: Om du kommer att behöva använda din radioligand under en längre tid kan stabilitet vara en faktor för dig. 125I-märkta ligander bör i allmänhet användas inom en till två månader från tillverkningsdatumet. Tritierade ligander bör vanligtvis användas inom 3-6 månader från tillverkningsdatumet, men det finns undantag från detta. Nedbrytningshastigheter och tillverkningsdatum finns på våra partispecifika tekniska datablad. Du kan också kontakta teknisk support för att diskutera den rekommenderade användningstiden för varje radiokemikalie från PerkinElmer – våra kontaktuppgifter finns i det övre högra hörnet på den här sidan.
• Energi: 3H avger betaenergi, som kan mätas på en scintillationsräknare efter tillsats av scintillationsmedel (i form av en scintillationscocktail, Meltilex® fast scintillationsmedel, en SPA-perla etc.). Beta-energin interagerar med scintillanten och ger upphov till fotoner som mäts av detektorn. 125I avger både betaliknande energi och gammaenergi. Om du bara har tillgång till en gammamätare bör du använda en radioligand märkt med 125I. En ytterligare faktor är testformatet. 125I avger mer betaliknande energi än 3H. För SPA-analyser kan antingen 3H- eller 125I-märkta ligander användas effektivt.

Radioaktiva ligandbindningsanalyser kan utföras i flera olika format. Vanligtvis utför vi denna analys i filtreringsformat, men analysen kan också utföras i SPA-format. SPA-formatet är ett homogent format, vilket innebär att inga tvättsteg krävs. I filtreringsanalysen tvättas obunden ligand bort med hjälp av en vakuumfördelare eller en cellskördare.

Top

Assay Formats

Filtreringsanalyser för bindning av ligander

Visa mer information om vilka material du behöver, vilka optimeringar du kan behöva utföra och referenser för radioaktiva ligandbindningsanalyser på filterplatta. I filtreringsformat utförs bindningsassayet först i en assayplatta och filtreras sedan genom en filtermat eller UniFilter®-platta med hjälp av en cellskördare (vakuumfördelare). Filtren tvättas för att avlägsna obunden radioligand. Filtermat- eller UniFilter-plattan torkas sedan och scintillationscocktail (eller Meltilex®) tillsätts innan den avläses i en lämplig detektor.

SPA-bandbindningsanalyser för ligander

Visa mer information om vilka material du behöver, vilka optimeringar du kan behöva utföra och referenser för SPA-radioligandbindningsanalyser. I SPA-formatet fångas cellmembranen upp på SPA-pärlor. När radioliganden binds till receptorn/membranet kommer den radiokemiska substansen i närheten av SPA-pärlan. Beta-energin från radioliganden kan interagera med scintillanten i pärlan och ge upphov till en signal som kan mätas. Radioligand som inte är bunden till cellmembranet kommer inte tillräckligt nära SPA-pärlan för att interagera starkt med scintillanten.

Översikt över ligandbindning

Definitioner

• Affinitet (potens): den täthet med vilken liganden binder till receptorn. Detta uttrycks vanligen som en jämviktskonstant, Kd. Ju lägre Kd-värde, desto högre affinitet
• Specificitet: beskriver hur selektiv en ligand är för en receptor jämfört med andra liknande receptorer
• Kd: Koncentrationen där 50 % av receptorerna är upptagna av radioliganden

Farmakologiska klassificeringar för ligander

Ligander

• Fullständig agonist: en ligand som binder till och aktiverar en receptor och utlöser ett maximalt svar
• Partiell agonist: en ligand som binder till en receptor och ger ett submaximalt svar
• Antagonist: en ligand som binder till en receptor som inte aktiverar receptorn. Antagonister utlöser inget svar när de appliceras på egen hand. De blockerar effekterna av en konkurrerande agonistligand.
• Invers agonist: en ligand som binder till en receptor och minskar svaret under basal nivå

Assays

I. Mättnadsexperiment: Mäter bindningsjämvikt genom att utföra en titrering av radioligand, samtidigt som mängden receptor hålls konstant.

Du kan använda mättnadskurvor för att bestämma Bmax (receptorns uttrycksnivå) och Kd (bindningsaffinitet för liganden).

Mättnadsexperiment

• Total bindning: Ökande koncentration av radioligand i frånvaro av kall ligand. Mäter både specifik bindning till receptorn och ospecifik bindning.
• Ospecifik bindning: Ökande koncentration av radioligand i närvaro av kall ligand. Mäter radioligandens bindning till icke-receptorkomponenter.
• Specifik bindning: Total minus ospecifik bindning. Mäter bindningen till receptorn specifikt.

II. Konkurrensexperiment: Mäter jämviktsbindning av en enda koncentration av radioligand i närvaro av olika koncentrationer av omärkt konkurrent.

Du kan använda konkurrenskurvor för att bestämma affiniteten hos ett stort antal omärkta föreningar för en receptor vid screening. IC50 och Ki kan härledas från konkurrensdata.

Konkurrenskurva

• IC50: Koncentration av en konkurrerande ligand som tränger undan hälften av den radioaktiva liganden
• Ki: Affinitet hos en kall ligand för receptorn

Anmärkningar: När man ändrar koncentrationen av radioliganden kan man observera en förskjutning av IC50 för en referensförening; Ki förblir dock densamma.

III. Kinetiska experiment: Mät bindningsnivån vid olika tidpunkter för att bestämma hastighetskonstanter för radioligandassociation och dissociation.

Kinetik

• Mättande koncentration av ligand tillsatt en mängd bunden över tid för att bestämma Kon
• Hög koncentration av omärkt konkurrent tillsatt. och minskning av bindningen över tiden mätt för att bestämma Koff

Top

Tips and FAQs

Idealt, vill du välja en radioligand som har följande egenskaper:

• Hög specifik aktivitet (> 20 Ci/mmol för en tritierad ligand)
• Låg icke-specifik bindning (hydrofoba ligander uppvisar generellt sett högre icke-specifik bindning)
• Hög renhet (typiskt > 90 % renhet)
• Hög selektivitet
• Stabilitet (om du kommer att behöva använda din radioligand under en längre tidsperiod, kan stabilitet vara en faktor. 125I-märkta ligander bör i allmänhet användas inom en till två månader från tillverkningsdatum. Tritierade ligander bör vanligtvis användas inom 3-6 månader från tillverkningsdatum (det finns dock undantag från detta).

När du plottar dina data rekommenderar vi att du använder den experimentellt bestämda koncentrationen av dina arbetslösningar med radioligand, snarare än en beräknad koncentration. Vissa radioligander kommer att fastna på väggarna i dina utspädningsrör. Det är viktigt att bestämma den verkliga koncentrationen av din pipetterade radioligand. För att experimentellt bestämma koncentrationen av en radioligandutspädning pipetterar du några mikroliter ur ditt utspädningsrör och lägger dem på en filtermatta. Du kanske också vill göra en 1/10-utspädning av detta prov, så att du kan dubbelkontrollera dina resultat. Bestäm dpms (sönderfall per minut). Konvertera från dpms till Curies med hjälp av följande ekvation:

1 Ci = 2,22 x 1012 dpm

Använd sedan den specifika aktiviteten för ditt parti radioligand för att konvertera från Curies till mol. För att bestämma den radioaktiva koncentrationen vid denna tidpunkt dividerar du antalet mol med volymen du spottat på filtermattan.

FAQs

Q. Vilken koncentration av radioligand ska jag använda för min mättnadskurva?
A. Vi rekommenderar i allmänhet att du väljer 3-5 koncentrationer under Kd och 3-5 koncentrationer över Kd. Den högsta koncentrationen bör vara tio gånger Kd.

Q.Vilken koncentration av radioligand bör väljas för kompetitiv bindning?
A. Radioliganden används vid en låg koncentration, vanligtvis vid eller under dess Kd-värde. Om den specifika aktiviteten är låg kan en koncentration över Kd-värdet användas, men den får aldrig vara vid eller högre än den mättande koncentrationen.

Q. Vilken typ av ligand ska jag använda för att bestämma ospecifik bindning i mina mättnadskurvor?
A. Du vill vanligtvis välja en ligand som är annorlunda än din radioligand. Du vill bara tränga undan radioligandens specifika bindning till receptorn. Du bör välja en ligand som har hög affinitet för receptorns bindningsställe och låg affinitet för icke-specifika bindningsställen.

Top

Andra PerkinElmer tekniker för bindning av receptor-ligand

• DELFIA fluorescerande receptor-ligand-bindningsanalyser

Top

Specialanpassade radiokemikalier, cellinjer, Membraner, frysta celler och receptorer

PerkinElmer erbjuder anpassade radiokemikalier, anpassade cellinjer och membraner, anpassade mikroplattor, SPA-pärlor och FlashPlates, samt utveckling av anpassade analyser. Om du är intresserad av kundanpassade tjänster kan du kontakta våra kundanpassade team:

ON>POINT® Custom Assay Development Services

Top

.