Resultat och diskussion
Konstitutiv aktivering av transkriptionsfaktorn NF-κB anses vara nödvändig för B-cellstransformation av API2-MALT1-fusionsprotein av MALT-lymfom med en translokation t(11;18) . Överexpression av API2-MALT1 i 293T-celler resulterar i en robust aktivering av en NF-κB luciferasreportergen , vilket ger ett användbart modellsystem för att studera de mekanismer genom vilka API2-MALT1 signalerar till NF-κB. För att övervaka transfekteringseffektiviteten samuttryckte vi pEGFP-N2 (Clontech) i ett antal experiment. Till vår förvåning observerade vi att EGFP hämmade NF-κB-aktivering inducerad av API2-MALT1 på ett dosberoende sätt (Fig 1A). Däremot påverkade EGFP inte den reporteraktivering som inducerades av uttryck av underenheterna p50/p65 av NF-κB (Fig 1B), vilket tyder på en störning av den NF-κB-signalkaskad som aktiveras av API2-MALT1 uppströms NF-κB.
- PowerPoint-bild
- större bild
- originalbild
(A) Aktivering av en NF-κB-luciferasreporter av ett flaggmärkt API2-MALT1-fusionsprotein hämmas av EGFP på ett dosberoende sätt.
(B) EGFP blockerar inte NF-κB-beroende luciferasaktivitet som induceras av uttryck av NF-κB:s p50/p65-underenheter. (C) Aktivering av en NF-κB luciferasreporter av Flag-API2-MALT1 hämmas av EGFP som är muterat för TRAF6-bindningsmotivet (D) EGFP men inte pmaxGFP förhindrar TNF-α-inducerad aktivering av NF-κB luciferasreportern och fosforylering av IκB-α och JUN i 293T-celler.
EGFP ökar inte HSP70-nivåerna eller inducerar HSP70B′ i 293T-celler.
Fluorescensintensiteter (Ex485/Em520nm) för EGFP och pmaxGFP var båda ∼100 gånger över bakgrunden. (E) N- och/eller C-terminala EGFP-fusionsproteiner (för API2, CHIC2, NXF5a, NXF1, MALT1, Actin, Rab5, Syndecan-bindningsprotein 2 (SDCBP2) eller β-Tubulin) och EGFP med en nukleär lokaliseringssignal (NLS) eller en farnysileringsplats (pEGFP-F) reducerar TNF-α-inducerad NF-κB-luciferasreporteraktivitet i 293T-celler. Botten: Hos människor uttrycks HSP70 konstitutivt under normala förhållanden, men Hsp70B′ induceras endast som svar på stress.
Det finns inget basalt uttryck av Hsp70B′.
Som positiv kontroll för uttrycket av HSP70B′ har 293T-celler (körfält 2) värmeskockats vid 44 °C i två timmar (körfält 3) och tillåtits återhämta sig vid 37 °C i 5 (körfält 4) eller 18 (körfält 5) timmar innan de skördas. NF-κB-beroende luciferasaktivitet representeras för varje experiment som viktad induktion av vektortransfekterade celler och representeras grafiskt som medelvärde och standardavvikelse för minst tre oberoende experiment.
Alla molekylviktsstandarder är i kDa.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g001
MALT1 är en väsentlig signalkomponent i antigen-receptorvägen mot NF-κB , . Man tror att BCL10 medierar oligomerisering av MALT1, vilket möjliggör bildandet av ett komplex med TRAF6. Oligomerisering av TRAF6 framkallar E3 ubiquitinligasaktiviteten hos dess RING-domän, vilket resulterar i modifiering av IKKγ (NEMO) via Lys63-länkade polyubiquitinkedjor. Detta underlättar sedan interaktionen mellan IKKγ och TGFβ-aktiverande kinas 1 (TAK1), som fullt ut aktiverar IκB-kinaskomplexet (IKK) via fosforylering av IKKβ, vilket leder till aktivering av NF-κB. På samma sätt aktiverar API2-MALT1-fusionsproteinet NF-κB via TRAF6-medierad polyubiquitering av IKKγ , . TRAF6:s interaktion med MALT1:s karboxyterminus sker via två potentiella TRAF6-bindningsmotiv (PxExxAr/Ac med Ar/Ac för en aromatisk eller sur rest . Inspektion av EGFP-sekvensen avslöjade närvaron av en TRAF6-bindande konsensus (PNEKRD, AA 212-217). EGFP:s kristallstruktur visar att PNEKRD-motivet är exponerat i en slinga mellan två betablad, vilket tyder på att det är tillgängligt och att EGFP kan spela en roll som negativ regulator genom att det avskiljer TRAF6. Co-IP-experiment kunde dock inte påvisa en interaktion mellan EGFP och TRAF6 (data visas inte) och mutanter för TRAF6-bindningskonsensus blockerade NF-κB-aktivering av API2-MALT1 lika effektivt som EGFP (Fig 1C).
För att undersöka om effekten var begränsad till API2-MALT1 analyserade vi TNF-α-inducerad NF-κB-aktivering i 293T-celler som uttrycker EGFP. Återigen minskade EGFP NF-κB-signalering, vilket visades av lägre reporteraktivitet och minskad fosforylering av NF-κB-inhibitorn IκB-α (fig. 1D). Därefter utvärderade vi om EGFP-fusionsproteiner skulle kunna ha samma effekt. Både N- och C-terminala EGFP-fusioner blockerade API2-MALT1- (data visas inte) och TNFα-inducerad NF-κB-aktivering (fig. 1E). Förutom att aktivera NF-κB-vägen utlöser TNF-α-behandling även JNK-signalering. Fosforylering av JUN, som indikerar aktiverad JNK-signalering, reduceras även av EGFP efter TNF-α-behandling (Fig 1D).
Det har rapporterats att långvarig visualisering av GFP-uttryckande celler inducerar produktion av reaktiva syrearter, vilket kan leda till fysiologiska förändringar och slutligen celldöd . Intressant nog hade båda EGFP-mutanter för TRAF6-bindningskonsensus förlorat sin gröna fluorescens men inhiberade effektivt NF-κB-signalering (fig. 1C). Dessutom påverkade pmaxGFP (Amaxa Biosystems), ett strukturellt annorlunda fluorescerande protein, inte NF-κB- och JNK-aktivering vid TNF-α-behandling (fig. 1D), vilket tyder på att inhiberingen inte berodde på fototoxicitet associerad med fria radikaler. En annan studie visade att höga nivåer av EGFP kan inducera värmeschockprotein 70 (HSP70) , som kan hämma NF-κB-aktiveringen via sin interaktion med IKKγ och TRAF6 . Induktionen av HSP70 var dock begränsad till endotelceller och vi observerade inte ökade HSP70-nivåer eller induktion av HSP70B′ i EGFP-uttryckande 293T-celler (fig. 1D-E).
NF-κB-aktivering genom API2-MALT1-uttryck eller vid TNF-α-behandling är förknippad med modifiering av IKKγ med Lys63-kopplat polyubiquitin av TRAF6 respektive TRAF2 , . Dessutom kräver TNFα-inducerad JNK-signalering TRAF2 auto-ubiquitinering . För att bedöma en eventuell effekt av EGFP på RING E3 ubiquitinligasaktiviteten hos TRAF6 eller TRAF2 övervakade vi ubiquitinering via en HA-märkt ubiquitinmutant med endast Lys63 tillgänglig för polymerisering (HA-Ub-K63). Uttryck av API2-MALT1 eller TNF-α-stimulering ökade nivån av polyubiquitinerade proteiner i 293T-celler och var förknippad med ökad IKKγ-polyubiquitinering i immunoprecipitat, och båda processerna blockerades av EGFP (Fig 2A, körfält 1,2,5,6). Dessutom minskade EGFP den basala nivån av K63-kopplad polyubiquitinering i 293T-celler (fig. 2A, körfält 3 och 4). På samma sätt stimulerar uttryck av API2-MALT1 eller TNFα-behandling K48-länkad ubiquitinkedjebildning, som återigen blockeras av EGFP och dess strukturella homolog dsRed (Clontech), men inte av pmaxGFP (Fig 2B).
- PowerPoint-bild
- större bild
- originalbild
(A) 293T-celler transfekterade med de angivna konstruktionerna och behandlade i 4 timmar med 20 ng/ml TNF-α (körfält 5 och 6) immunoblottas med anti-Flag (API2-MALT1), anti-HA (HA-Ub-K63) och anti-EGFP-antikroppar (vänster panel) eller anti-IKKγ-immunutfällningar immunoblottas med anti-Flag (IKKγ) eller anti-HA (ubiquitin) (höger panel).
(B) EGFP påverkar K48-länkad polyubiquitinering.
293T-celler transfekterades med en ubiquitinkonstruktion med endast Lys48 tillgänglig för polymerisering (HA-Ub-K48), behandlades i 4 timmar med 20 ng/ml TNF-α eller lämnades obehandlat och celllysat immunoblottas med antikroppar anti-HA (Ub-K48) och anti-EGFP.
Fluorescensintensiteten (excitation 485/Emission 520 nm) för EGFP och pmaxGFP var jämförbar (∼100 gånger högre än bakgrundsvärdena), uttrycket av pDs-Red bekräftades med fluorescensmikroskopi.
(C) EGFP stabiliserar exogen API2-Myc i 293T-celler via minskning av dess Lys48-länkade auto-ubiquitinering och proteasomal nedbrytning.
(D) Stabilt uttryck av EGFP i merkelcellscellcancercelllinjen MCC14.2 minskar polyubiquitinering och ökar de endogena p53-uttrycksnivåerna.
Det genomsnittliga förhållandet och standardavvikelsen mellan p53- och aktinsignaler anges (tre oberoende experiment), (Ub)n : polyubiquitinerade proteiner.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g002
För att undersöka om EGFP uteslutande påverkar ubiquitinering av TRAF-proteiner utvärderade vi API2, ett RING E3 ubiquitinligas som destabiliserar sig självt via Lys48-kopplad auto-ubiquitinering . Co-expression av EGFP hämmade polyubiquitinering inducerad av API2 i 293T-celler, vilket resulterade i en ökning av API2-uttrycksnivåerna (Fig 2C). Minskade steady-state nivåer av ubiquitinering observerades också i MCC14.2-celler med stabilt uttryck av EGFP. Som en följd av detta är basala nivåer av endogent p53, som regleras noggrant genom Lys48-kopplad ubiquitinering av MDM2, något förhöjda i EGFP-uttryckande celler (fig. 2D).
Nästan undersökte vi om EGFP påverkar ubiquitinering in vivo. De basala nivåerna av polyubiquitinering minskade i miltlymfocyter från EGFP-transgena möss , vilket var förknippat med minskad fosforylering av IκB-α efter antigenstimulering jämfört med kontrollmöss, vilket tyder på att EGFP minskar den B-cellreceptorinducerade NF-κB-aktiveringen (Fig 3A-B). API2-MALT1-transgena möss har ett underskott av B220+/CD40+ B-celler i benmärgen eftersom API2-MALT1-medierad NF-κB-aktivering påskyndar deras mognad till naiva B-celler . När dessa API2-MALT1-transgena möss korsades med EGFP-möss återställdes underskottet av B220+/CD40+ B-celler i benmärgen hos EGFP/API2-MALT1-dubbeltransgena möss (fig. 3C), vilket ytterligare stöder en påverkan på ubiquitinering och NF-κB-signalering in vivo. På samma sätt minskade polyubiquitinering i leverceller från EGFP-möss och var förknippad med stabilisering av p53, vilket visades av ökningen av dess uttrycksnivå (fig 3A, D). Den viktigaste målgenen för p53 vid γ-strålningsinducerad DNA-skada i levern är p21, som krävs för cellcykelstopp och DNA-reparation . Följaktligen orsakade γ-strålningsinducerad DNA-skada inte bara ett högre p53-svar hos EGFP-möss utan även induktionen av p21 ökade något (fig. 3D). Slutligen utfördes in vitro-experiment för att utvärdera om EGFP direkt påverkar ubiquitinkedjans sammansättning; rekombinant EGFP påverkade dock inte polyubiquitinering av ett kontrollsubstrat (Fig 3E), vilket tyder på en cellkontextberoende effekt av EGFP på ubiquitinering.
- PowerPoint-bild
- större bild
- originalbild
(A) Western blots av mjälte- och leverextrakt från FVB vildtyp (wt) och EGFP-transgena möss som detekteras med antikroppar mot Ubiquitin, EGFP och aktin (laddningskontroll).
(B) EGFP minskar fosforylering av IκB-α i anti-IgM/anti-CD40-stimulerade B-lymfocyter som renats från EGFP-möss.
Experiment utförda i tre exemplar, en representativ bild av ett experiment visas.
Genomsnittet och standardavvikelserna för förhållandet mellan IκB-α-P och aktin i förhållande till ostimulerade celler anges.
(C) Underskottet av B220+/CD40+ B-celler i benmärgen hos API2-MALT1-möss återställs hos EGFP/API2-MALT1-dubbeltransgena möss.
Experiment utförda i tre exemplar, medelvärde och standardavvikelser redovisas. eMalt1: endogent Malt1, *a-specifikt band (D) EGFP-möss visar ökade p53-nivåer i levern och har förstärkta p53/p21-svar vid γ-strålningsinducerad DNA-skada.
Genomsnittet och standardavvikelserna för förhållandet mellan p53/p21- och aktinsignaler i förhållande till prov 1 anges.
(E) Rekombinant EGFP (rEGFP) förhindrar inte polyubiquitinering av ett Biotin-Lysozym-substrat in vitro. (Ub)n: polyubiquitinerade proteiner.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g003
Slutsatsen är att våra data tyder på att EGFP och EGFP-fusionsproteiner påverkar RING E3 ubiquitinligasberoende processer som NF-κB- och JNK-signalering eller p53-homeostas i cellinjer och hos möss. NF-κB spelar en central roll i regleringen av olika biologiska processer, inklusive medfödd och adaptiv immunitet, utveckling, celltillväxt och överlevnad . De överlevnadsfrämjande signalerna beror på ett förhöjt uttryck av apoptoshämmare, t.ex. B-cellsleukemi/lymfom-XL. Därför kan ökningen av apoptos som induceras av EGFP i celler eller i motorisk cortex och striatum i hjärnan hos möss vara relaterad till minskad NF-κB-aktivitet på grund av defekt polyubiquitinering och aktivering/nedbrytning av dess uppströmsregulatorer. Defekt ubiquitinering postuleras också vara orsaken till limb girdle muscular dystrophy, som är förknippad med mutationer i Trim32, ett ubiquitinligas för aktin . Eftersom EGFP har visat sig försämra interaktionen mellan aktin och myosin i muskelceller och inducera dilaterad kardiomyopati hos EGFP-möss är det frestande att spekulera i att ubiquitinering av aktin kan spela en viktig roll för normal muskelfunktion och att dess avreglering av EGFP orsakar de ovan nämnda fenotyperna. Med tanke på den nya roll som ubiquitinering spelar i många cellulära processer bör därför användningen av EGFP som en reporter för levande celler övervägas noggrant.
Lämna ett svar