Nucleolus

Nucleolus finns i cellkärnan.

Nucleolus (plural nucleoli) är en stor, distinkt, sfäroidal underavdelning av cellkärnan i eukaryota celler som är platsen för syntesen av ribosomalt RNA (rRNA) och sammansättning av ribosomala underenheter. En nukleoli kallas ibland för en ”icke-membranös organell” eller ”kärnmembranlös organell” i den bredare betydelsen av termen organell. Nukleoli saknar dock ett membran och är därför inte organeller i den mer tekniska betydelsen av strukturer som är separat inneslutna i sitt eget lipidmembran. De flesta växt- och djurceller har en eller flera nukleoler, men vissa celltyper har inga.

Nukleolus är en mycket dynamisk struktur från vilken komponenterna sprids i början av mitosen och återmonteras i slutet av celldelningen. Denna intrikata kropp arbetar i samarbete med andra kärnkomponenter för att tillhandahålla en värdefull funktion för cellen. När denna komplexa samordning i mänskliga celler störs, till exempel genom virusinfektion, medfödda mutationer eller ökad aktivitet, kan dock flera mänskliga sjukdomar uppstå.

Översikt

Schematisk bild av en typisk djurcell, som visar subcellulära komponenter. Organeller:
(1) nukleolus
(2) kärna
(3) ribosomer (små prickar)
(4) vesikel
(5) grovt endoplasmatiskt retikulum (ER)
(6) Golgiapparat
(7) cytoskelett
(8) slätt endoplasmatiskt retikulum (ER)
(9). Mitokondrier
(10) Vacuole
(11) Cytoplasma
(12) Lysosom
(13) Centrioler inom centrosom

Nukleolus är en stor och distinkt nukleär struktur som är starkt organiserad och saknar membran. Nukleolus huvudsakliga funktion är biogenesen och sammansättningen av ribosomkomponenter (rRNA, ribosomala proteiner). Denna plats för transkription av ribosomalt DNA (rDNA) har kallats en ”ribosomproducerande maskin” (Alberts et al. 1989). Nucleolus kan visualiseras med hjälp av elektronmikroskopi medan organisationen och dynamiken kan studeras med hjälp av Fluorescent Protein Tagging och Fluorescent Recovery after Photobleaching (FRAP).

I en icke-mitotisk cell, observerad i ljusmikroskop, är nucleolus den tydligaste strukturen i kärnan (Alberts et al. 1989). Under de inledande stadierna av celldelningen fragmenteras dock nukleolerna (de kan inte längre ses i metafas). Vid övergången mellan telofas och interfas. samlas de på nytt kring de kromatinregioner där rDNA-transkriptionen återupptas. RDNA-sekvenserna kodar för ribosomernas rRNA-molekyler (ribosomalt RNA).

Istället för att vara bunden av ett membran tycks nukleolerna byggas upp genom att oavslutade ribosomprekursorer binds samman på ett specifikt sätt, vilket bildar ett stort nätverk (Alberts et al. 2004). Tre regioner av en nukleolus kan urskiljas: ett fibrillärt centrum (som innehåller DNA som inte aktivt transkriberas), en tät fibrillär komponent (innehåller RNA-molekyler som transkriberas) och en granulär komponent (innehåller mognande ribosomala prekursorpartiklar) (Alberts et al. 1989). Denna senare region bidrar till att göra gränsen mot den omgivande nukleoplasman distinkt, trots avsaknaden av ett membran.

Då nukleolerna utför produktionen och mognaden av ribosomer, finns ett stort antal ribosomer inuti dem. Förutom ribosombiogenesen tros nukleolerna ha andra roller i den cellulära aktiviteten. Enligt ny forskning är nukleolerna dessutom ansvariga för trafiken av olika framträdande små RNA-arter. Nucleolus hjälper dem under deras mognadsprocess och väg till sin slutliga cellulära destination. Även om nukleolerna blir osynliga under celldelningen har nya studier dessutom visat att de är involverade i regleringen av cellcykeln. Flera av dess icke-traditionella roller omfattar interaktion med virala komponenter, reglering av tumörsuppressor- och onkogenaktiviteter, sammansättning av signaligenkänningspartiklar, modifiering av små RNA-strängar, kontroll av åldrande och modulering av telomerasfunktionen.

De tidiga cytologerna var så intresserade av de lätt synliga nukleolerna att en översikt från 1898 listade cirka 700 referenser (Alberts et al. 1989). Cytologer visade på 1940-talet att nukleoler innehåller höga koncentrationer av RNA och proteiner (Alberts et al. 1989). År 1964 upptäckte John Gurdon och Donald Brown cellkärnor i den afrikanska klövgrodan Xenopus laevis. De fann att 25 procent av groddjursäggen inte hade någon nukleolus och att sådana ägg inte var kapabla till liv. Hälften av äggen hade en nukleolus och 25 procent hade två. De drog slutsatsen att nukleolus hade en funktion som var nödvändig för livet. År 1966 visade Max L. Birnstiel und Hugh Wallace via hybridiseringsexperiment att nukleolerna kodar för ribosomalt DNA.

Nukleolusens morfologi

Nukleoler består typiskt sett av tre morfologiskt distinkta regioner, som kan visualiseras med hjälp av elektronmikroskopi (EM) (Hernandez-Verdun 2006a; 2006b; Olson och Dundr 2005; Raška et al. 2006; Thiry och Lafontaine 2005):

1. Fibrillärt centrum (FC):

• lätt färgat när det observeras med EM
• består av ”fibriller” (± 50Ǻ i Ø)
• närvaro av pol I och UBF
• mångfaldigt FC i en nukleolus
• kontoret utgör endast 1-2 procent av den totala volymen av nukleolus

2. Dense Fibrillar Center eller Dense Fibrillar Component (DFC):

• omger FC:s
• som består av ”tätt packade fibriller” (30-50 Ǻ i Ø)
• upptar en stor del av nukleolus, ± 17 procent och återspeglar i grova drag det nukleolära engagemanget i ribosombiogenesen

3. Granulär region eller granulär komponent (GR):

• region som omfattar både FC och DFC
• bestående av granuler 150-200 Ǻ i Ø
• granulerikt område på grund av närvaron av RNP-partiklar
• med en fraktion på cirka 75 procent, den upptar den största fraktionen av den totala nukleolusvolymen
• Och även om nukleolus inte är membranbunden, på grund av närvaron av GC, är gränsen mot det omgivande kromatinet och nukleoplasman vanligtvis distinkt.

En väsentlig (ytterligare) komponent i nukleolus är kromatin, som tränger in i organellen från det omgivande nukleoplasma.

En kontinuerlig länk mellan nukleoplasma och de inre delarna av nukleolus finns genom ett nätverk av nukleolära kanaler. På detta sätt kan makromolekyler med en molekylvikt på upp till 2 000 kDa lätt distribueras i hela nukleolus.

En sista struktur identifieras inom nukleolus och benämns nukleolär vakuole. Det finns flera nukleolära vakuoler i nukleolus, men det är fortfarande oklart om de tjänar något funktionellt eller strukturellt syfte.

Och även om den ”tredelade” organisationen (FC, DFC, GC) av nukleolus är allmänt accepterad, har det föreslagits att denna speciella organisation endast observeras i högre eukaryoter och att den utvecklades från en tvådelad organisation med övergången från anamnioter till amnioter. Som en återspegling av den betydande ökningen av den intergena rDNA-regionen skulle en ursprunglig fibrillär komponent ha delats upp i FC och DFC (Thiry och Lafontaine 2005).

Nukleolus och rDNA-transkription/rRNA-bearbetning/ribosomsammansättning

Nukleolusammansättningen sker inte slumpmässigt. Nucleoli bildas runt specifika genetiska loci som kallas nucleolar organizing regions (NOR). En NOR, som tidigare beskrevs av McClintock som det ”nukleolära organiserande elementet”, består av tandemrepetitioner av rRNA-gener som finns i flera kopior i hela genomet. Det mänskliga genomet innehåller till exempel mer än 200 kopior av rRNA-genen och de är grupperade på fem olika kromosomer. I en typisk eukaryot består en rRNA-gen av en promotor, interna och externa transkriberade spacer (ITS/ETS), rRNA-kodande sekvenser (18S, 5,8S, 28S) och ett externt ”icke” transkriberat spacer (Alberts et al. 2002).

Inför ribosombiogenesen krävs tre eukaryotiska RNA-polymeraser (pol I, II, III), som fungerar på ett samordnat sätt. I ett inledande skede transkriberas rRNA-generna som en enda enhet inom nukleolus av RNA pol I. För att denna transkription ska kunna ske krävs flera pol I-associerade faktorer och rDNA-specifika transaktionsfaktorer. I jäst är de viktigaste UAF (upstream activating factor), TBP (tata-box binding protein) och CF (core factor), som binder promotorelement och bildar pre-initiationskomplexet (PIC), som i sin tur känns igen av pol I.

I människor sätts ett liknande PIC samman med SLI, promotorselektivitetsfaktorn, som består av TBP och TBP-associerade faktorer (TAF), IF, transkriptionsinitieringsfaktorn, och UBF, uppströmsbindande faktor.

Transkriptionen av ribosomgenen ger en lång prekursormolekyl (45S pre-rRNA), som fortfarande innehåller den interna transkriberade sapcer (ITS) och den externa transkriberade spaced (ETS). Ytterligare bearbetning, som inbegriper metylering och endo/exonukleasaktivitet, krävs därför för att generera 18S rRNA-, 5,8S- och 28S rRNA-molekylerna. De RNA-modifierande enzymerna förs till sina respektive igenkänningsställen genom interaktion med guide-RNA, som binder dessa specifika sekvenser. Guide-RNA:n tillhör klassen små nukleolära RNA:n (snoRNA:n), som är komplexa med proteiner och existerar som små nukleolära-ribonukleoproteinpartiklar (RNP) (snoRNP:n).

När rRNA:n har bearbetats är rRNA-molekylerna redo att sättas samman till ribosomer. En ytterligare RNA-molekyl, 5S rRNA, är dock nödvändig för denna biogenes. I jäst är 5S rDNA-sekvensen lokaliserad i den externa ”icke” transkriberade spacern och transkriberas i nukleolus av RNA pol III. I högre eukaryoter och växter är situationen mer komplex, för 5S rDNA-sekvensen ligger utanför NOR och transkriberas i nukleoplasman, varefter den importeras i nukleolus för att delta i ribosomens sammansättning. Denna sammansättning omfattar inte bara rRNA utan även ribosomala proteiner. De gener som kodar för dessa r-proteiner transkriberas av pol II i nukleoplasman genom en ”konventionell” proteinsyntesväg (transkription, pre-mRNA-bearbetning, nukleär export av moget mRNA och översättning till cytoplasmatiska ribosomer). De mogna r-proteinerna återimporteras sedan till nukleolus. Föreningen och mognaden av rRNA och r-proteiner resulterar i bildandet av ribosomens 40S- och 60S-underenheter. Dessa exporteras genom kärnporalkomplexen till cytoplasman där de förblir fria eller kommer att associeras med det endoplasmatiska retikulumet (Alberts et al. 2002; Cooper och Hausman 2007).

Nukleolär organisation och dynamik

Mångfaldiga nukleolära proteiner och små nukleolära RNA (snoRNA) associeras för att bilda det bearbetningsmaskineri som krävs i ribosombiogenesen. De är involverade i modifieringen av de framväxande rRNA-transkriptionerna genom metylering (2′-O-metylering/pseudouridylering) och endonukleolytisk klyvning av pre-RNA:erna. Dessa bearbetningssteg är huvudsakligen begränsade till DFC (den täta fibrillära komponenten), vilket framgår av närvaron av dessa snoRNP (små nukleära ribonukleoproteinpartiklar) som utgör proteiner, t.ex. fibrillarin, nukleolin och U3 snoRNA. Protein B23 och NOP52, som är involverade i senare stadier av bearbetningen. är lokaliserade i GC (granulär komponent).

Detta visar att organisationen av nukleolerna är starkt reglerad och beroende av stadierna i bearbetningen av rRNA. Dessa observationer har också lett till hypotesen att transkriptionen av rDNA måste ske i FC (fibrillärt centrum) eller i korsningen mellan FC och DFC på grund av den vektoriella utåtriktade rörelsen av pre-RNA-transkriptionerna medan de bearbetas för att ge mogna rRNA:er.

Om man beaktar den kompletta uppsättningen av proteiner och RNA som behövs i ribosombiogenesen kan vi anta att en nukleolus helt enkelt bildas därför att vissa proteiner, som är involverade i transkriptionen av rDNA-generna, binder till sina målregioner, och att det runt omkring dem sker en spontan sammansättning av alla de element som är involverade i modifieringen av de framväxande rRNA:erna. Organiseringen sker därför som en följd av ribosombiogenesen.

Flera experimentella tillvägagångssätt har använts för att få en detaljerad bild av denna speciella sammansättningsprocess. De viktigaste är Fluorescent Protein Tagging, där ett intressant protein fusioneras med ett fluorescerande protein såsom ”grönt fluorescerande protein” (GFP) och Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) som går ut på att märka ett protein med ett fusionsprotein varefter de fluorescerande molekylerna i det studerade området bleks med en laser. Den fluorescerande intensiteten i det studerade området kommer att återhämta sig på grund av att blekta molekyler sprids utåt och oblekta molekyler sprids inåt. Den förstnämnda metoden gör det möjligt att hålla reda på det fluorescerande komplexets rörelse (3D+tid) och den sistnämnda gör det möjligt att mäta det fluorescerande proteinets uppehållstid (tid som tillbringas i ett visst område) (med andra ord att mäta den intracellulära rörligheten).

Båda de experimentella metoderna bygger på förmågan att märka en hel rad nukleolusassocierade proteiner, t.ex. nukleolära proteiner, histoner, DNA-bindningsproteiner, transkriptionsfaktorer och spliceosomer. Genom att spåra och mäta uppehållstiden för de märkta proteinerna kunde man visa att nukleolära proteiner snabbt associeras/avskiljs från andra nukleolära komponenter, att proteiner kontinuerligt utbyts mellan nukleolus och nukleoplasma under interfasen och att dessa nukleolära proteiner är involverade i andra nukleära domäner. Man har till exempel funnit att Cajalkroppar (CB) är berikade på små nukleära och nukleolära ribonukleoproteiner och att de innehåller flera nukleolära associerade bearbetningsproteiner, t.ex. fibrillarin. Därför har det föreslagits att det bör finnas ett funktionellt samband mellan nukleoler och Cajalkroppar (Hernandez-Verdun 2006a, 2006b).

Flera experimentella observationer tyder på att rekryteringen av de element som konstituerar nukleolerna sker på ett icke slumpmässigt sätt och att den regleras av cellcykelns progression. Under mitosen förblir transkriptionsmaskineriet nära associerat med rDNA. Transkriptionen undertrycks dock av proteinkinaskomplexet cyklin B/Cdk1 (PMF). Detta komplex aktiveras i början av mitosen och undertrycker kärnverksamheten genom att fosforylera ett antal proteinkinaser eller strukturella proteiner som är involverade i de cellulära omläggningar som krävs för en korrekt celldelning. Det är i slutet av mitosen, när PMF bryts ned genom proteolytisk klyvning av cyklin B, som nukleolerna åter samlas runt rDNA-platserna som ett svar på att rDNA-transkriptionen återupptas. Nukleolärproteinerna är, till skillnad från de proteiner som är involverade i transkriptionen, lokaliserade vid kromosomernas periferi under cellcykelns M-fas. Detta kan visualiseras med hjälp av fluorescerande proteinmärkning. Vid övergången från telofas till G1 är majoriteten av dem grupperade i prenukleolära kroppar (PNB). Det är dessa PNB som utför translokationen från kromosomerna till de platser där transkriptionen av rDNA har påbörjats. PNB:erna tros fungera som en samlingsplattform och som en reservoar för proteinkomplex, som frigör bearbetningsproteinerna på de platser där rDNA-transkriptionen äger rum. Tidiga bearbetningsproteiner, t.ex. fibrillarin, rekryteras som svar på en minskning av cyklin B/Cdk1-aktiviteten, medan sena bearbetningsproteiner, t.ex. B23 och Nop52, rekryteras som svar på cyklinberoende kinas (cdk) aktivitet. På detta sätt kan de olika bearbetningsproteinerna frigöras exakt vid den tidpunkt då de behövs under rRNA-syntesen (Hernandez-Verdun 2006a, 2006b).

Mänskliga sjukdomar som är förknippade med nukleolus

Mänskliga sjukdomar som är förknippade med en funktionsstörning i nukleolus kan orsakas av virusinfektioner, ökad nukleolär aktivitet eller helt enkelt av medfödda mutationer som påverkar de nukleolära proteinerna.

Om ett virus innehåller en nukleolär målsignal (NOS) i sin arvsmassa kommer en del viruspartiklar att riktas mot nukleolus. Så är fallet med humant immunbristvirus (HIV), som styr HIV-1 Rev-proteinet till nukleolus. Genom interaktion med det nukleolära proteinet B23 tjänar det sitt syfte genom att reglera splicingmönstret för hiv-1 mRNA, eftersom det främjar exporten av ospliced mRNA till cytoplasman. Det har föreslagits att Rev-proteinet är lokaliserat i nukleolus för att tillhandahålla en alternativ translokationsväg för viralt (osplicerat/delvis splicat) mRNA från nukleoplasman till cytoplasman. På detta sätt skyddas det virala mRNA:t mot nedbrytning (vilket normalt skulle ske för att skydda cellen mot översättning av pre(obearbetat)-mRNA).

En ökad nukleolär aktivitet kommer att ha en effekt på överproduktionen av ribosomer, vilket så småningom kommer att leda till tumörgenes och cancer. En nyckelfaktor i dessa dysfunktionella nukleoler är proteinet c-myc, produkt av c-myc-proto-onkogenen. Det stimulerar ribosombiogenesen genom att direkt reglera pol I, påverka transkriptionen av pol II, III och genom att associera med SL1-komponenten i preinitieringskomplexet, vilket ökar effektiviteten i rekryteringen av pol I till preinitieringskomplexet.

Det har dessutom beskrivits flera medfödda mutationer som påverkar nukleolproteinerna: Weine syndrom, Treacher Collins syndrom och dyskeratosis congenital syndrome (Hernandez-Verdun 2006a, 2006b; Raška et al. 2006).

Nukleolär dominans

Nukleär dominans har också visats för rRNA-gener. I vissa organismer, särskilt växter, när två kärnor kombineras till en enda cell under hybridisering, kan den utvecklande organismen ”välja” en uppsättning rRNA-gener för transkription. Den andra förälderns rRNA-gener undertrycks och transkriberas i allmänhet inte, även om reaktivering av de undertryckta eller ”sämre” rRNA-generna ibland kan förekomma. Denna selektiva preferens för transkription av rRNA-gener kallas nukleolär dominans.

• Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts och J. D. Watson. Molecular Biology of the Cell, andra upplagan. New York: Garland Publishing, 1989. ISBN 0824036956.

• Alberts, B., A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts och P. Walter. 2002. Cellens molekylärbiologi, fjärde upplagan. New York: Garland Science. ISBN 0815332181.

• Cooper, G. M. och R. E. Hausman. 2007. The Cell: A Molecular Approach. Washington, DC: ASM Press. ISBN 9780878932191.

• Hernandez-Verdun, D. 2006a. [http://www.springerlink.com/content/75n545v0g3186830 Nucleolus: Från struktur till dynamik. Histochem Cell Biol 125: 127-137. Hämtad den 8 juli 2008.

• Hernandez-Verdun, D. 2006b. The nucleolus: En modell för organisationen av kärnfunktioner. Histochem Cell Biol 126: 135-148. Hämtad den 8 juli 2008.

• Khadzhiolov, A. A. 1985. The Nucleolus and Ribosome Biogenesis. Wien: Springer-Verlag. ISBN 3211817905.

• Olson, M. O. J. 2004. The Nucleolus. Georgetown, TX: Landes Bioscience/ Eurekah.Com. New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers. ISBN 0306478730.

• Olson, M. O. J., och M. Dundr. 2005. Nucleolus rörliga delar. Histochem Cell Biol 123: 203-216. Hämtad den 8 juli 2008.

• Raška, I., P. J. Shaw och D. Cmarko. 2006. Nya insikter om nukleolär arkitektur och aktivitet. International Review of Cytology 255: 177-235. Hämtad den 23 juli 2008.

• Thiry, M. och L. J. Lafontaine. 2005. Födelse av en nukleolus: The evolution of nucleolar compartments. Trends in Cell Biology 15 (4). Hämtad den 8 juli 2008.

• Thiry, M., och G. Goessens. 1996. Nucleolus under cellcykeln. New York: Springer; Austin, TX: R.G. Landes. ISBN 3540613528.

Alla länkar hämtade 14 december 2018.

• Nucleolus under elektronmikroskop II.

Akrosom | Kloroplast | Cilium/Flagellum | Centriol | Endoplasmatiskt retikulum | Golgiapparat | Lysosom | Melanosom | Mitokondrion | Myofibril. | Kärna | Parenthesom | Peroxisom | Plastid | Ribosom | Vacuole | Vesikel