Väljning av lämpliga restriktionsenzymer baserat på definierade kriterier
För att gå vidare med ett kortfattat exempel klonades tdTomato fluorescerande protein in i en alpharetroviral vektor. Därefter genererades en murin leukemicellinje som uttrycker tdTomato. Denna cellinje kommer att användas för att spåra tumörceller vid injektion i möss i prekliniska immunterapistudier. Denna kloningsmetod kan dock tillämpas på vilken annan gen som helst. För att påbörja kloningsprojektet bör genen av intresse (GOI) analyseras. Först kontrollerar vi om vår annoterade sekvens har en startkodon (ATG, den vanligaste startkodonen) och en av de tre stoppkodonerna (TAA, TAG, TGA). Om genen tidigare har manipulerats eller fusionerats med en annan gen (t.ex. via en 2A-sekvens) händer det att en gen av intresse kanske inte har en stoppkodon. I sådana fall måste en stoppkodon läggas till i slutet av din annoterade sekvens. Det är också fördelaktigt att undersöka om din GOI innehåller en öppen läsram (ORF). Detta är viktigt eftersom frekvent manipulering av sekvenser, antingen med hjälp av programvara eller genom kloning, felaktigt kan lägga till eller ta bort nukleotider. Vi använder programmet Clone Manager (SciEd) för att hitta ORF:er i våra plasmidsekvenser, men det finns flera kostnadsfria webbplatser som du kan använda för att hitta ORF:er, bland annat NCBI open reading frame finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html).
Den tdTomato genen innehåller ATG-startkodon och TAA-stoppkodon (figur 1). Storleken på tdTomato genen är 716 bp.
Översikt över start- och slutpunkten för den aktuella genen. (A) Nukleotidsekvenserna i början och slutet av genen tdTomato visas. De kodande strängens nukleotider anges med fet stil. (B) Nukleotidsekvenserna för de framåt- och bakåtriktade primers som innehåller lämpliga restriktionsenzymplatser och Kozak-sekvensen visas.
I nästa steg måste PCR-primers som innehåller lämpliga restriktionsenzymplatser utformas för amplifiering av GOI. Flera kriterier bör beaktas för att välja de optimala restriktionsenzymerna. För det första bör bindningsställen för restriktionsenzymerna helst vara tillgängliga på en multipel kloneringsplats i vektorn. Alternativt kan de placeras nedströms från promotorn i din vektorssekvens. Restriktionsenzymerna bör vara single cutters (single cutters riktar in sig på endast en restriktionsplats inom en DNA-sekvens) (figur 2A). Om de är dubbla eller multipla skärare bör de skära i en sekvens som inte är nödvändig för att vektorplasmidet ska fungera korrekt och kommer slutligen att avlägsnas (figur 2B). Det är också möjligt att välja ett enzym som skär vektorn nedströms från promotorn och inte heller inom en viktig sekvens i plasmidet (figur 2C). Dubbla eller multipla skärande enzymer har två eller flera restriktionsställen på en DNA-sekvens. Om vektorn skärs av med dubbla eller multipla skärare skulle det ge upphov till två identiska ändar. I ett sådant fall bör insättningskassetten också innehålla samma restriktionsenzymställen i båda ändarna. När insatsen och vektorfragmenten blandas i ett ligeringsexperiment kan därför insatsen smälta samman med vektorn antingen i rätt riktning (från startkodon till stoppkodon) eller omvänt (från stoppkodon till startkodon). Ett tredje scenario kan uppstå om vektorfragmentet bildar en självligerande cirkel där insatsen inte alls ingår. När DNA:t har inkuberats med restriktionsenzymer kommer avfosforylering av vektorplasmidets 5′- och 3′-ändar med hjälp av ett alkaliskt fosfatasenzym att kraftigt minska risken för självligering. Det är därför viktigt att efter fragmentligering screena en kloningsprodukt för dessa tre produkter (rätt orientering, omvänd orientering, självligering).
Välja rätt restriktionsenzymer utifrån definierade kriterier för PCR-kloning. (A) Två enkelskärande restriktionsenzymer (E1 och E2) är placerade nedströms från promotorn. (B) Restriktionsenzymerna E1 och E2 skär plasmidet nedströms promotorn flera gånger (här två gånger för varje enzym). (C) Restriktionsenzym E1 skär plasmiden nedströms promotorn mer än en gång. (D) PCR-produkten, som innehåller tdTomato-genen och restriktionsenzymställena, kördes på en gel innan den extraherades för tillämpningar nedströms.
För det andra, på grund av högre kloningseffektivitet med hjälp av DNA-fragment med klibbiga ändar, är det önskvärt att minst ett (bättre båda) av restriktionsenzymerna är en s.k. klibbig änd-klippare. Sticky end cutters klyver DNA asymmetriskt och genererar komplementära kohesiva ändar. Däremot skär trubbiga ändar sekvensen symmetriskt och lämnar inga överhäng. Det är svårare att klona fragment med trubbiga ändar. Genom att välja ett högre molförhållande mellan insat/vektor (5 eller mer) och använda 10 % polyetylenglykol (PEG) kan man dock förbättra ligeringen av fragment med trubbiga ändar.
För det tredje klipper vissa restriktionsenzymer inte metylerat DNA. De flesta stammar av E. coli innehåller Dam- eller Dcm-metylaser som metylerar DNA-sekvenser. Detta gör dem resistenta mot metyleringskänsliga restriktionsenzymer. Eftersom vektor-DNA oftast framställs i E. coli kommer det att vara metylerat. Det är därför önskvärt att undvika metyleringskänsliga restriktionsenzymer, men ibland är isoschizomeren av ett metyleringskänsligt restriktionsenzym resistent mot metylering. Till exempel är Acc65I-enzymet känsligt medan dess isoschizomer kpnI är resistent mot metylering. Isoschizomerer är restriktionsenzymer som känner igen samma nukleotidsekvenser. Om det inte finns något annat alternativ än att använda metyleringskänsliga restriktionsenzymer måste vektor-DNA:t framställas i dam – dcm – E. coli-stammar. En förteckning över dessa stammar och även vanliga E. coli-värdstammar för molekylär kloning sammanfattas i tabell 1. Information om restriktionsenzymers metyleringskänslighet tillhandahålls vanligtvis av tillverkaren.
För det fjärde underlättar det kloningen om den buffert som krävs för restriktionsenzymers fulla funktionalitet är densamma, eftersom man då kan utföra dubbla restriktionsdigester. Detta sparar tid och minskar DNA-förlusten vid rening. Det kan hända att ett av restriktionsenzymerna är aktivt i en buffert och att det andra enzymet är aktivt i dubbelt så hög koncentration i samma buffert. Till exempel är NheI-enzymet från Thermo Scientific aktivt i Tango 1X-buffert (Thermo Scientific) och EcoR1-enzymet är aktivt i Tango 2X-buffert (Thermo Scientific). I sådana fall måste plasmid-DNA först smältas med det enzym som kräver den högre buffertkoncentrationen (här EcoR1). Detta kommer att följas av utspädning av bufferten för nästa enzym (som kräver en lägre koncentration (här NheI)) i samma buffert. Framväxten av universella buffertar har dock förenklat den dubbla smältningen av DNA-sekvenser. I vårt exempel innehåller vektorn restriktionsplatserna AgeI och SalI. Dessa enzymställen användes för att utforma PCR-primers (figur 1). Det är viktigt att plasmidens renhet är hög för att restriktionsenzymspjälkningen ska fungera korrekt. DNA-absorptionen som mäts med en spektrofotometer kan användas för att bestämma renheten efter rening. DNA, proteiner och lösningsmedel absorberas vid 260 nm, 280 nm respektive 230 nm. Ett OD 260/280-förhållande på >1,8 och ett OD 260/230-förhållande på 2 till 2,2 anses vara rent för DNA-prover. OD 260/280- och 260/230-förhållandet för våra exemplariska plasmidpreparat var 1,89 respektive 2,22. Vi observerade att renheten hos de gelextraherade vektor- och insert-DNA-fragmenten var lägre efter restriktionsdigestring; ligering fungerar även i sådana fall, men bättre resultat kan dock förväntas om man använder högrenhetsfragment.
Följande webbplats för plasmidförråd kan vara användbar för val av olika vektorer (viralt uttryck och paketering, tomt ryggrad, fluorescerande proteiner, inducerbara vektorer, epitoptaggar, fusionsproteiner, reportergener, artspecifika uttryckssystem, selektionsmarkörer, promotorer, shRNA-uttryck och genome engineering):http://www.addgene.org/browse/.
En samling kloningsvektorer från E. coli finns på följande webbplats:http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/cvector/cvectorExplanation.jsp.
Utformning av kloningsprimers baserat på definierade kriterier
För utformning av PCR-primers ska du kontrollera start- och stoppkodonerna i din GOI. Hitta sekvensen för de önskade restriktionsenzymerna (finns på tillverkarnas webbplatser) för den framåtriktade primern (figur 3A). Den måste placeras före GOI (figur 1B). Den så kallade Kozak-sekvensen finns i eukaryota mRNA och förbättrar initieringen av translation. Det är fördelaktigt att lägga till Kozak-sekvensen (GCCACC) före ATG-startkodonet eftersom den ökar översättningen och uttrycket av det intressanta proteinet i eukaryoter. Därför har vi infört GCCACC omedelbart efter restriktionsenzymsekvensen AgeI och före ATG-startkodonet. Därefter läggs de första 18-30 nukleotiderna i GOI från ATG-startkodonet till den framåtriktade primersekvensen. Dessa överlappande nukleotider som binder sig till DNA-mallen bestämmer glödgningstemperaturen (Tm). Den senare är vanligtvis högre än 60 °C. Här använder vi Phusion high-fidelity DNA-polymeras (Thermo Scientific). Du kan använda följande webbplatser för att bestämma den optimala Tm:http://www.thermoscientificbio.com/webtools/tmc/.
Utformning av primers utifrån definierade kriterier för PCR-kloning. (A-B) Sekvenserna för den framåtriktade och den omvända primern visas. Slutet av den kodande strängen ska omvandlas till det omvända komplementformatet för utformningen av den omvända primern. För mer information, se texten.
https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/tm-calculator.
Tm för vår framåtriktade primer är 66°C.
Välj de sista 18 till 30 nukleotiderna, inklusive stoppkodonet i din GOI, för utformning av den omvända primern (figur 3B). Beräkna sedan Tm för denna sekvens, som bör ligga över 60 °C och nära Tm för den framåtriktade primern. Tm för den överlappande sekvensen i vår omvända primer var 68 °C. Lägg sedan till målsekvensen för den andra restriktionsenzymplatsen (i det här fallet SalI) omedelbart efter stoppkodonet. Slutligen omvandlar du denna sammansatta sekvens till en sekvens med omvänt komplement. Följande webbplatser kan användas för att bestämma sekvensen för den omvända primern:
http://reverse-complement.com/
http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.htmlThis är viktig eftersom den omvända primern binder till den kodande strängen och därför måste dess sekvens (5′ → 3′) vara omvänt komplementär till sekvensen för den kodande strängen (figur 1A).
Uppförande av PCR med hjälp av proofreading-polymeraser
Då PCR-reaktionen följer logaritmisk amplifiering av målsekvensen kommer alla replikationsfel under denna process att amplifieras. Felprocenten för icke-proofreading DNA-polymeraser, t.ex. Taq-polymeras, är cirka 8 × 10-6 fel/bp/PCR-cykel. Proofreading-enzymer, t.ex. Phusion-polymeras, har dock en rapporterad felprocent på 4,4 × 10-7 fel/bp/PCR-cykel. På grund av dess överlägsna tillförlitlighet och processivitet användes Phusion DNA-polymeras i detta exempel. Det bör noteras att Phusion har andra temperaturkrav än andra DNA-polymeraser. Primer Tm för Phusion beräknas enligt Breslauer-metoden och är högre än Tm vid användning av Taq- eller pfu-polymeraser. För att få optimala resultat bör Tm beräknas utifrån information som finns på enzymleverantörernas webbplats. På grund av den högre hastigheten hos Phusion räcker det dessutom vanligen med 15-30 sekunder för amplifiering av varje kb av den aktuella sekvensen.
Efter PCR måste produkten laddas på en gel (figur 2D). Motsvarande band måste skäras och DNA extraheras. Det är viktigt att sekvensera PCR-produkten eftersom PCR-produkten kan innehålla mutationer. Det finns flera PCR-kloneringssatser tillgängliga, varav några visas i tabell 2. Vi använde kloningsvektorn pJET1.2/blunt (Thermo Scientific, patentpublikation: US 2009/0042249 A1, Genbank accession number EF694056.1) och klonade in PCR-produkten i den linjäriserade vektorn. Denna vektor innehåller en dödlig gen (eco47IR) som aktiveras om vektorn blir cirkulariserad. Om PCR-produkten klonas in i kloneringsplatsen inom den dödliga genen bryts den senare, vilket gör att bakterierna kan odla kolonier vid transformationen. Cirkulära vektorer som inte innehåller PCR-produkten uttrycker den giftiga genen, som därför dödar bakterier och förhindrar bildandet av kolonier. Bakteriekloner skall sedan odlas, plasmid-DNA isoleras och sekvenseras. Kvaliteten på den isolerade plasmiden är avgörande för optimala sekvenseringsresultat. Vi isolerade plasmid-DNA från totalt 1,5 ml odlade bakterier (utbyte 6 μg DNA; OD 260/280 = 1,86; OD 260/230 = 2,17) med hjälp av ett kit för plasmidminipreparering (QIAGEN). Hela PCR-processen, inklusive kloning av PCR-produkten i sekvenseringsvektorn och transfektion av bakterier med sekvenseringsvektorn kan göras på en dag. Nästa dag odlas bakterieklonerna över natten innan de skickas för sekvensering.
Analys av sekvenseringsdata
Sekvenseringsföretagen rapporterar normalt sekvenseringsdata som en FASTA-fil och även som färdiga nukleotidsekvenser via e-post. För sekvensanalys kan följande webbplatser användas:
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
http://xylian.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi
Här kommer vi att fokusera på den första webbplatsen. På denna webbsida klickar du på alternativet ”nucleotide blast” (figur 4A). Ett nytt fönster öppnas. Som standard är alternativet ”blastn” (blast nucleotide sequences) markerat (figur 4B). Markera sedan rutan bakom ”Align two or more sequences”. Nu visas två rutor. I rutan ”Enter Query Sequence” (den övre rutan) infogar du den önskade sekvensen av din gen av intresse, som flankeras av de restriktionsställen som du redan har utformat för dina PCR-primers. I rutan ”Enter Subject Sequence” (den nedre rutan) skriver du in sekvensen eller laddar upp FASTA-filen som du har fått från sekvenseringsföretaget. Klicka sedan på knappen ”BLAST” längst ner på sidan. Efter några sekunder kommer resultaten att visas på en annan sida. En del av anpassningsdata visas i figur 4C. För tolkningen bör följande punkter beaktas: 1) Antalet identiska nukleotider (som visas under punkten ”Identities”) måste vara lika med nukleotidantalet för din gen av intresse. I vårt exempel var antalet nukleotider i tdTomato genen tillsammans med restriktionsenzymställena och Kozak-sekvensen 735. Detta motsvarar det rapporterade antalet (figur 4C). 2) Sekvensidentiteten (under punkten ”Identities”) ska vara 100 %. Ibland är sekvensidentiteten 100 % men antalet identiska nukleotider är lägre än förväntat. Detta kan hända om en eller flera av de ursprungliga nukleotiderna saknas. Kom ihåg att alla sekvenseringstekniker har en felprocent. För Sanger-sekvensering rapporteras denna felprocent ligga mellan 0,001 % och 1 %. Nukleotiders substitution, borttagning eller insättning kan identifieras genom att analysera sekvenseringsresultaten. Om sekvensidentiteten inte uppgår till 100 % bör plasmiden därför sekvenseras på nytt för att skilja PCR-fel från enkla sekvenseringsfel. 3) Luckor (under punkten ”Luckor”) får inte förekomma. Om luckor förekommer bör plasmiden sekvenseras på nytt.
Sekvensanalys av PCR-produkten med hjälp av NCBI BLAST-plattformen. (A) På NCBI BLAST-webbplatsen har alternativet ”nucleotide blast” valts (markerat med den ovala linjen). (B) Alternativet ”blastn” visas som standard (markerat med cirkeln). Sekvensen för den aktuella genen (flankerad av de restriktionsplatser som tidigare utformats för PCR-primerna) och PCR-produkten ska föras in i rutorna ”Enter Query Sequence” och ”Enter Subject Sequence”. Sekvenser kan också laddas upp som FASTA-filer. (C) Nukleotidanpassning av de första 60 nukleotiderna visas. Två viktiga punkter för sekvensanalys är markerade med ovala linjer.
Den genomsnittliga längden på en avläsning, eller avläsningslängden, är minst 800-900 nukleotider för Sanger-sekvensering. För pJET-vektorn måste en framåtriktad och en bakåtriktad primer användas för att sekvensera hela genen. Dessa primers kan normalt täcka en genstorlek på upp till 1800 bp. Om genens storlek är större än 1800 bör en extra primer utformas för varje 800 extra nukleotider. Eftersom tillförlitlig basbestämning inte börjar omedelbart efter primern, utan cirka 45-55 nukleotider nedströms från primern, bör nästa framåtriktade primer utformas så att den börjar cirka 700 nukleotider efter genens början. Olika webbplatser, bland annat följande, kan användas för att designa dessa primers:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer
http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/sequencing_primer_design
Med en längd på 735 bp låg storleken på PCR-produkten i det här exemplet väl inom intervallet för pJET-sekvenseringsprimers.
Efter att ha valt den sekvensverifierade klonen, smältes vektor- och insatsplasmiderna med restriktionsenzymerna AgeI och SalI (figur 5). Detta följdes av gelrening och ligering av fragmenten. Transformation av kompetent E. coli med ligeringsblandningen gav flera kloner som undersöktes med restriktionsenzymer. Vi bedömde åtta kloner, som alla innehöll tdTomatoinsatsen (figur 6). Det är viktigt att välja kloner som är stora. Satellitkloner kanske inte har rätt konstruktion. Vi använde ett snabbt plasmidminiprepareringskit (Zymo Research) för att extrahera plasmidet från 0,6 ml bakteriesuspension. Avkastningen och renheten var tillfredsställande för restriktionsenzymbaserad screening (2,3 μg DNA; OD 260/280 = 1,82; OD 260/230 = 1,41). För storskalig plasmidrening användes ett maxi-preparationskit (QIAGEN) för att extrahera plasmidet från 450 ml bakteriekultur (avkastning 787 μg DNA; OD 260/280 = 1,89; OD 260/230 = 2,22). Den förväntade avkastningen av en plasmidisolering från pBR322 från 1,5 ml och 500 ml bakteriekultur är cirka 2-5 μg respektive 500-4000 μg DNA.
Kartor över vektorer och insatsplasmider A) Illustration av CloneJET-plasmiden som innehåller PCR-produkten. Insertion av PCR-produkten i plasmidens kloneringsplats stör integriteten hos den toxiska genen eco47IR och möjliggör tillväxt av transgenpositiva kloner. Plasmiden klipptes med enzymerna AgeI och SalI och gav upphov till två fragment på 3 kb och 0,7 kb. Fragmentet på 0,7 kb (tdTomato genen) användes som insert för kloning. (B) Illustration av vektorplasmidet. Plasmiden klipptes med enzymerna AgeI och SalI och genererade två fragment på 4,9 kb och 0,7 kb. Fragmentet på 4,9 kb användes som vektor för kloning. AMP: Ampicillinresistensgen; PRE: posttranskriptionellt regulatoriskt element; MPSV: promotor för myeloproliferativt sarkomvirus.
Screening av den slutgiltiga plasmiden med restriktionsenzymer. Illustration av den slutliga plasmiden visas. För screening klipptes plasmidet med enzymet BsiwI vilket genererade två fragment på 4,8 kb och 0,8 kb. AMP: Ampicillinresistensgen, PRE: posttranskriptionellt reglerande element, MPSV: promotor för myeloproliferativt sarkomvirus.
Vissa plasmider tenderar att rekombineras i bakterievärden, vilket skapar insertioner, deletioner och rekombinationer. I dessa fall kan det vara användbart att använda en E. coli med recA-brist (tabell 1). Om GOI är toxisk kan man dessutom undvika problemet genom att inkubera bakterierna vid lägre temperaturer (25-30 °C) och använda ABLE C- eller ABLE K-stammar.
Viral produktion och transduktion av målceller
För att undersöka in vitro-uttrycket av den klonade genen transfekterades HEK293T-celler med plasmider som kodar för tdTomato genen, alfaretroviral Gag/Pol och vesikulärt stomatitvirus glykoprotein (VSVG) kuvert. Dessa celler, som härrör från mänskliga embryonala njurar, är lätta att odla och transfektera. Därför används de i stor utsträckning inom bioteknik och genterapi för att generera viruspartiklar. HEK293T-celler måste delas varannan dag med varmt medium. De bör inte nå 100 % konfluens för optimala resultat. För att få god transfektionseffektivitet måste dessa celler odlas i minst en vecka så att de befinner sig i logfas. Transfektionseffektiviteten var 22 %, vilket bestämdes utifrån uttrycket av tdTomato genom fluorescensmikroskopi 24 timmar senare (figur 7A-B). För att generera en murin leukemicellinje som uttrycker tdTomato-genen för immunterapistudier transducerades C1498 leukemiceller med nyskördade virus (36 timmars transfektion). Bildstudier (figur 7C) och flödescytometrisk analys (figur 7D) fyra dagar efter transduktionen bekräftade uttrycket av tdTomato i majoriteten av cellerna.
Bedömning av in vitro uttryck av den klonade genen. (A, B) HEK293T-celler transfekterades med plasmiderna Gag/Pol, VSVG och tdTomato. Uttrycket av tdTomato genen bedömdes med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Fluorescerande bilder överlagrades på en ljusfältsbild för differentiering av positivt transducerade celler. Transfektionseffektiviteten bestämdes utifrån uttrycket av tdTomato efter 24 timmar. Icke-transfekterade HEK293T-celler användes som kontroller (blått histogram). (C, D) Den murina leukemicellinjen C1498 transducerades med färskt virus. Fyra dagar senare bedömdes transgenuttrycket med fluorescensmikroskopi (C) och flödescytometri (D). Icke-transducerade C1498-celler användes som kontroller (blått histogram). Skala staplar representerar 30 μm.
Lämna ett svar