Molekylär identifiering av Mycobacterium-arter av betydelse för folkhälsan och veterinärmedicinen från nötkreatur i den södra delstaten México

Abstract

Mycobacterium-släktet orsakar en rad olika zoonotiska sjukdomar. Det mest kända exemplet är den zoonotiska tuberkulos som beror på M. bovis. Mycket mindre är känt om ”icke tuberkulösa mykobakterier (NTM)”, som också är förknippade med infektioner hos människor. Den mexikanska standarden NOM-ZOO-031-1995 reglerar förekomsten av M. bovis hos nötkreatur, men det finns ingen reglering för NTM-arter. Syftet med denna studie var att isolera och identifiera icke tuberkulösa mykobakteriearter från nötkreatur från lokala besättningar i den södra delen av delstaten Mexiko genom identifiering och upptäckt av den molekylära markören på 100 bp i 23S rRNA-genen med efterföljande sekvensering av 16S rRNA-genen. Mjölkprover (35) och prover från nasala exsudat (68) samlades in. Av de 108 isolerade stammarna valdes 39 ut för identifiering. Tretton stammar som isolerats från nasala exsudat amplifierade den molekylära markören på 100 bp och identifierades som M. neoaurum (sex stammar), M. parafortuitum (fyra stammar), M. moriokaense (två stammar) och M. confluentis (en stam). Förutom M. parafortuitum är de andra identifierade arterna av betydelse för folkhälsan och veterinärmedicinen eftersom de är patogena för människor, särskilt de med underliggande medicinska tillstånd.

1. Introduktion

Släktet Mycobacterium orsakar en mängd olika zoonotiska sjukdomar. Det mest kända exemplet är zoonotisk tuberkulos orsakad av M. bovis, för vilken nötkreatur är den huvudsakliga reservoaren. M. bovis ingår i ”tuberkuloskomplexet”, som också omfattar arterna M. tuberculosis, M. africanum, M. caprae och M. microti .

Inom mykobakteriegruppen finns ”icke tuberkulösa mykobakterier (NTM)”, som också är förknippade med infektioner hos människor. NTM finns i olika miljökällor som jord, vatten, vegetation, djur, mejeriprodukter och avföring och kan överföras oavsiktligt genom inandning, förtäring eller hudpenetration .

Den mexikanska standarden NOM-ZOO-031-1995 reglerar förekomsten av M. bovis hos nötkreatur för att kontrollera och utrota bovin tuberkulos (bTB); det finns dock ingen reglering för NTM-arter. Den officiella diagnosen av bovin tuberkulos på grund av förekomst av M. bovis på fältnivå baseras på ett intradermalt test med hjälp av ett renat proteinderivat (tuberkulin) . Även om detta test har använts i flera år ger det ingen god känslighet och specificitet. Ungefär 20 % av djuren med tuberkulos reagerar inte på testet , och närvaron av andra mykobakteriearter, både tuberkuloskomplex och NTM-arter, orsakar störningar som leder till falskt positiva och falskt negativa diagnoser.

Trots att Mexiko har en regleringsstandard rapporteras en förekomst av tuberkulos på över 2 % i vissa områden . Med tanke på tuberkulintestets dåliga specificitet och känslighet är den faktiska förekomsten av M. bovis troligen lägre och infektionsgraden hos nötkreatur med andra mykobakterier troligen högre. Därför kan nötkreatursuppfödare, veterinärer, tekniker och anställda inom boskapsindustrin vara yrkesmässigt exponerade för infektioner med M. bovis och NTM. Mycket lite är känt om yrkesmässig exponering för zoonoser orsakade av NTM-arter eftersom identifiering av dessa arter var en ganska svår uppgift före utvecklingen av identifieringstekniker baserade på molekylärbiologi.

För närvarande är de molekylärbiologiska tekniker som oftast används för att diagnostisera sjukdomar orsakade av mykobakterier restriktionsfragmentlängdpolymorfism (RFLP) för diagnostisering av M. tuberkulos , spoligotypning för diagnos av M. bovis , och detektering av en 100 baspar (bp) ”specifik infogning” i 23S rRNA-genen som är karakteristisk för grampositiva bakterier med hög halt av guanin-cytosin (HGC) och som anses vara en molekylär markör för denna grupp bakterier , följt av sekvensanalys av 16S rRNA-genen för identifiering av bakterier på artnivå .

Av de NTM-arter som identifierats med ovannämnda tekniker är M. balnei, M. marinum och M. platypoecilus, som har orsakat ytliga och djupa hudskador ; M. kansasii från lungskador ; M. simiae från generaliserade infektioner ; M. scrofulaceum från infektioner i hud och inre organ ; M. szulgai i samband med lunginfektioner, osteomyelit, tenosynovit och lymfadenit ; M. ulcerans i samband med subkutana granulom ; M. fortuitum och M. chelonae i samband med vaskulit, endokardit, osteomyelit, mediastinit, hjärnhinneinflammation, keratit och hepatit ; M. abscessus i samband med erytematösa lesioner som utvecklades till ulcererade knölar ; och andra arter.

Den största procentandelen av den statliga inventeringen av nötkreatur i delstaten Mexiko i Mexiko är koncentrerad till den södra regionen, och en av de viktigaste ekonomiska verksamheterna är boskapsskötsel . Den mexikanska förordningen om kontroll av nötkreatur NOM-ZOO-031-1995 fokuserar endast på tuberkulintestet för diagnos av M. bovis. Man vet inte mycket om förekomsten av NTM hos nötkreatur i regionen. Med tanke på möjligheten att identifiera arter av aktinobakterier genom att detektera den molekylära markören med 100 baspar på 23S rRNA-genen och den efterföljande sekvenseringen av 16S rRNA-genen är det möjligt att identifiera de ovannämnda NTM-arterna.

Syftet med den här studien var att isolera och identifiera NTM-arter från nötkreatur i den södra regionen i delstaten Mexiko. Mycobacterium-arterna isolerades från prover av nasalt exsudat och nötmjölk och identifierades genom att detektera den molekylära markören på 100 baspar i 23S rRNA-genen med efterföljande sekvensering av 16S rRNA-genen.

2. Material och metoder

2.1. Provtagning

En provtagning utfördes baserat på den rumsliga fördelningen av besättningar som är positiva för bovin tuberkulos i delstaten Mexiko som utfördes av Zaragoza et al. 2015 . Fyra nötkreatursbesättningar valdes ut i den södra regionen av delstaten Mexiko, en besättning som tillhör kommunen Temascaltepec och tre besättningar som tillhör kommunen Zacazonapan. Totalt 103 prover, 35 mjölkprover och 68 prover av nasalt exsudat, samlades in. Fördelningen av antalet och typen av prover som samlades in i varje besättning visas i tabell 1.

2.2. Upptagning av prover av mjölk och nasalt exsudat

Utter och bröstvårtor rengjordes med renat vatten och tvål och torkades sedan med hushållspapper, och bröstvårtorna aseptiserades därefter med hjälp av svabbar indränkta i 70-procentig alkohol. Fem milliliter mjölk samlades upp direkt från bröstvårtan i sterila 20 ml-kärl och det första flödet kasserades. Nasalt exsudat samlades upp direkt från insidan av näsöppningen med hjälp av en 10 cm lång steril svabb, som sedan sänktes ner i en isotonisk saltlösning (0,85 %). Proverna av mjölk och nasalt exsudat förvarades vid 4 °C tills de bearbetades.

2.3. Behandling av prover

2.3.1. Isolering av mykobakterier

Mjölkproverna centrifugerades vid 2500 varv per minut (rpm) i 10 minuter. Pelleterna från mjölkproverna och proverna från näsan inokulerades i följande odlingsmedium som var selektivt för mykobakterier: Stonebrink (BD BBL 220504), Middlebrook (BD BBL 254521) och Middlebrook (BD BBL 254521) kompletterat med 6 g natriumpyruvat per liter (Middlebrook-P). De inokulerade medierna inkuberades vid 37 °C i 8 veckor och bedömdes var tredje dag.

2.3.2. Klassificering av isolerade stammar

De isolerade stammarna fördelades i grupper enligt följande egenskaper: kolonipigmentering, tillväxttid och koloniegenskaper (form, konsistens, textur och pigmentproduktion). Isolerade stammar färgades med Ziehl-Neelsen för att bekräfta förekomsten av syrafasta bakterier (AFB) .

2.4. DNA-extraktion

Stammar med mikroskopiska egenskaper som liknar mykobakterier (syrafast positivitet) och två representativa stammar från varje grupp valdes ut för identifiering. För att erhålla biomassa inokulerades stammarna i 30 mL Middlebrook flytande kulturmedium (BD BBL 254521) i 125 mL kolvar och inkuberades vid 37 °C i 7 dagar. Det flytande mediet överfördes till sterila 15 mL Falcon-rör och centrifugerades i 15 minuter vid 14 000 rpm. Därefter avlägsnades supernatanten och pelleten överfördes till 1,5 mL Eppendorf-rör; rören centrifugerades sedan vid 14 000 rpm × 5 minuter och supernatanten kasserades. DNA-extraktion utfördes på den resulterande pelleten med hjälp av Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega A1120).

2.5. Detektion av den molekylära markören i 23S rRNA-genen

Den molekylära markören på 100 bp i 23S rRNA-genen amplifierades enligt den metod som beskrivs av Roller et al. (1992) med hjälp av följande primers: 23S InsF, 5′-(AC)A(AGT)GCGTAG(AGCT)CGA(AT)GG-3′, och 23S InsR, 5′-GTG(AT)CGGTTT(AGCT)(GCT)GGTA-3′.

Reaktionen genomfördes med hjälp av ett kommersiellt Taq-dna-polymeras (Promega M1661). Följande termiska cykelförhållanden användes: ett fördenatureringssteg i 5 minuter (94 °C), 29 cykler med denaturering i 30 sekunder (94 °C), hybridisering i 45 sekunder (46 °C) och förlängning i 50 sekunder (72 °C) och slutligen en cykel efter förlängning i 5 minuter (72 °C). De amplifierade fragmenten bekräftades på en 2 % agarosgel färgad med etidiumbromid (SIGMA 46065).

2.6. Amplifiering av 16S rRNA-genen

Stammar som amplifierade den fylogenetiska markören på 100 bp valdes ut för 16S rRNA-sekvensanalys. Följande primers användes för amplifieringen: 8f: AGAGTTTGATATCMTGGCTCAG och 1492r: TACGGYTACCTTGTTACGACTT.

Reaktionen genomfördes med hjälp av ett kommersiellt Taq DNA-polymeras (Promega M1661). Följande termiska cykelförhållanden användes: ett fördenatureringssteg i 5 minuter (94 °C), 34 cykler med denaturering i 30 sekunder (94 °C), hybridisering i 20 sekunder (52 °C) och förlängning i 1 minut och 30 sekunder (72 °C), och slutligen en postförlängningscykel på 7 minuter (72 °C).

De amplifierade fragmenten bekräftades på en 1 %-ig agarosgel som färgats med etidiumbromid (SIGMA 46065). Produkterna från denna amplifiering renades med hjälp av Amicon Ultra Filter®-kitet (Millipore UFC901008) och bekräftades på en 1 % agarosgel för att verifiera deras närvaro och kvalitet.

2.7. Identifiering av mykobacteriumarter

De amplifierade produkterna av 16S rRNA-genen skickades till Macrogen Sequencing Service, Maryland, USA. De erhållna sekvenserna analyserades och korrigerades med hjälp av programmet BioEdit . Konsensussekvenser konstruerades från de framåtriktade och bakåtriktade fragmenten, som jämfördes med sekvenser som tidigare deponerats i GenBank of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) med hjälp av BLAST-programmet och EzTaxon 2.1 .

2.8. Fylogenetisk analys

Sekvenser av 16S rRNA-genen erhölls för följande mykobakteriearter från American Type Culture Collection (ATCC) och German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSM): M. neoaurum ATCC25795, M. parafortuitum DSM43528, M. moriokaense och M. confluentis . Sekvenserna för stammarna i samlingen och sekvenserna för de stammar som isolerades i den aktuella undersökningen anpassades med programmet BioEdit . Den fylogenetiska analysen utfördes med hjälp av maximum parsimony-metoden i programvaran MEGA version 4 . För att bilda roten i kladogrammet användes sekvensen av Pantoea agglomerans DSM 3493.

3. Resultat

De 108 stammarna som isolerades från de 103 insamlade proverna fördelades i 13 grupper enligt deras makroskopiska och mikroskopiska morfologiska egenskaper (tabell 2). Grupperna 11 och 12 bestod särskilt av syrafasta stammar.

För identifiering på artnivå valdes 39 stammar ut: 10 av dem hörde till grupp 11 och 7 till grupp 12. Två stammar från var och en av de återstående 11 grupperna valdes ut för att komplettera de 39 stammarna. Den molekylära markören på 100 bp hittades i 33 % (13/39) av de utvalda stammarna. För dem amplifierades 16S rRNA-genen för sekvensering och identifiering på artnivå.

Den totala prevalensen av NTM i de insamlade proverna var 12,6 % (13/103) om man beaktar både mjölk- och nässexudatprover. Den specifika prevalensen för prover med nasalt exsudat var dock 19,1 % (13/68).

Enligt sekvensjämförelsen identifierades fyra NTM-arter av släktet Mycobacterium. 64 % (6/13) av stammarna hade 98 % och 99 % likheter med M. neoaurum, medan 31 % (4/13) hade 99 % likheter med M. parafortuitum, 15 % (2/13) hade 98 % och 99 % likheter med M. moriokaense och slutligen 8 % (1/13) hade 99 % likheter med M. confluentis (tabell 3).

Det fylogenetiska trädet bildades med släktet Mycobacterium och fyra av dess arter genom vilket de fylogenetiska relationerna mellan insamlingsstammarna och de stammar som isolerades i den aktuella undersökningen observerades (figur 1).

Figur 1

Fylogenetiskt träd som konstruerats genom att jämföra 16S rRNA-gensekvenserna från de isolerade och referensstammarna.

4. Diskussion

NTM-arter isolerades endast från prover av nasalt exsudat, vilket eliminerade proverna från en av de lokala gårdarna i denna studie (tabell 1). Vi fann att den specifika prevalensen var 19,1 % i besättningar i den södra regionen av delstaten Mexiko. Liknande studier i USA, Sydafrika, Tanzania och Brasilien rapporterade NTM-prevalensvärden på 3,4 %, 24,5 %, 7 % respektive 7,8 %; därför ligger det prevalensvärde som hittades i denna studie inom det intervall som tidigare rapporterats . I denna studie identifierades 13 av de 39 analyserade stammarna som NTM-arterna M. neoaurum, M. moriokaense, M. confluentis och M. parafortuitum.

M. neoaurum, en medlem av Mycobacterium parafortuitum-komplexet, är ansvarig för ett brett spektrum av sjukdomar, varav de flesta är anordningsrelaterade infektioner, t.ex. Hickman-katetrar, BROVIAC-katetrar, PICC-ledningar , arteriovenösa fistlar som inkluderade ett polytetrafluoretylen-transplantat , pace-makers , och endokardit i protesklaffar . Immunsupprimerade patienter som innehar dessa anordningar är de främsta värdarna, t.ex. cancerpatienter och diabetiker med njursvikt och hjärtproblem . M. neoaurum har också isolerats från patienter med urininfektioner , meningoencefalit och förändringar i det centrala nervsystemet , bakteriemi och endokardit samt lunginfektioner . Även om den huvudsakligen har isolerats från kliniska fall finns det också rapporter om isolering från mjölk och nötkreatur.

M. moriokaense isolerades från sputumprov . Även om den anses vara icke-patogen för människor har den förknippats med lungsjukdomar . M. confluentis isolerades också från sputumprover , och tillsammans med M. parafortuitum anses båda vara icke-patogena arter. M. confluentis, M. moriokaense och M. neoaurum har isolerats från olika vävnader från nötkreatur och vilda djur med tuberkulösa lesioner, medan M. parafortuitum endast har isolerats från mjölk från nötkreatur . I vårt arbete isolerades dock M. parafortuitum endast från prover från nasalt exsudat.

Mykobakteriernas näringsbehov skiljer sig åt mellan olika arter, vilket var anledningen till att olika odlingsmedier användes. Noterbart är att sju av de 13 stammarna som identifierades i den här studien isolerades i Stonebrink-medium, inklusive M. neoaurum, M. parafortuitum och M. moriokaense. Detta resultat stämmer överens med det som beskrivs av Sepúlveda et al. som angav att Stonebrink-mediet är lämpligt för återvinning av olika arter av släktet Mycobacterium. García-Martos och García-Agudo rapporterade att Middlebrook-mediet är optimalt för isolering av aktinomyceter, vilket stämmer överens med föreliggande undersökning med tanke på att två arter, M. neoaurum och M. parafortuitum, isolerades i detta medium. Särskilt M. confluentis isolerades endast i Middlebrook-medium kompletterat med natriumpyruvat; strategin att använda olika odlingsmedier var alltså lämplig eftersom den möjliggjorde isolering av olika arter av släktet Mycobacterium.

Detekteringen av den molekylära markör som finns i 23S rRNA-genen hos Gram-positiva bakterier med HGC-innehåll möjliggjorde en diskriminering mellan stammar av eubakterier och mykobakterier. Sekvenseringsanalysen av 16S rRNA-genen möjliggjorde identifiering på artnivå; därför är kombinationen av dessa metoder lämplig för identifiering av NTM-arter.

5. Slutsatser

Med hjälp av den metodik som beskrivs i denna studie isolerades och identifierades fyra NTM-arter: M. confluentis, M. moriokaense, M. neoaurum och M. parafortuitum. Dessa arter isolerades för första gången från nasala exudat från nötkreatur från den södra delen av delstaten Mexiko. Tre av de identifierade arterna (M. neoaurum, M. moriokaense och M. confluentis) är av betydelse för folkhälsan och veterinärmedicinen.

Offentliggörande

Detta arbete härrör från avhandlingen för doktorsexamen i hälsovetenskap (Universidad Autónoma del Estado de México), registrerad i PNPC-CONACYT.

Intressekonflikter

Alla författare förklarar att de inte har några intressekonflikter.

Acknowledgments

Författarna vill tacka för det ekonomiska stödet från sekretariatet för forskning och avancerade studier vid Universidad Autónoma del Estado de México (UAEMex) genom följande forskningsbidrag: (i) ”Implementation of Geographic Information Systems and Techniques of Molecular Biology, as tools in the detection and identification of Mycobacterium spp.”, SIEA-UAEM 3486/2013CHT, och (ii) nätverket ”Microbiología y química en las Ciencias de la Salud”, 039/2014RIF.