Resultat

För att hitta den maximala emissionsvåglängden för att övervaka fluorescensintensiteten hos AMC efter trypsinklyvning mättes excitations- och emissionsspektren, som visas i figur 1. Den maximala emissionsvåglängden är 440 nm.

Emissionsspektrum (blått) och fluorescensspektrum (rött) för 50 µmol/L AMC
Figur 1. Emission (blå) och fluorescens (röd) av 50 µmol/L AMC.

För att standardisera den uppmätta fluorescensintensiteten i enzymlösningen till koncentrationen av isolerad AMC utfördes en titrering och fluorescensen mättes. 0,5 mL alikvot av en 50 µmol/L AMC-lösning tillsattes till en 2,5 mL enzymlösning och de initiala och slutliga koncentrationerna av isolerad AMC sammanfattas i tabell 1.

Tabell 1. Koncentrationer av isolerad AMC före och efter standardisering av fluorescensintensiteten.

Initialkoncentration 3 6 15 30 60 120 240
Finell koncentration 0.5 1 2,5 5 10 20 40

Trypsinaktivitetens kinetik erhölls sedan genom att mäta fluorescensintensiteten hos isolerad AMC vid klyvning av trypsin från substratet. Figur 2 visar tidsförloppsmätningen efter att 0,5 mL av varierande koncentrationer av substratlösningen Boc-Gln-Ala-Arg-MCA tillsattes till 2,5 mL av enzymlösningen.

Fluorescensintensitet av varierande substratkoncentrationer som tillsattes till enzymlösningen. Substratkoncentrationerna är de slutliga koncentrationerna enligt tabell 1.
Figur 2. Fluorescensintensitet för olika substratkoncentrationer som tillsätts till enzymlösningen. Substratkoncentrationerna är de slutliga koncentrationerna i tabell 1.

Med hjälp av programmet Kinetics Analysis ritades en Lineweaver-Burk-graf (figur 3) från fluorescenstidsmätningarna i figur 2. Lineweaver-Burk-grafen ger enzymkinetiska parametrar som den maximala reaktionshastigheten, Vmax, och Michaelis-Menten-konstanten, Km. Vmax beskriver reaktionshastigheten när enzymet är mättat med substrat medan Km anger mängden substrat för att nå den maximala reaktionshastigheten. Vmax var 35 270 nmol/L-min-1 och Km var 5,99. Linjens ekvation var 1/v = 0,000270 – 1/ + 0,0000284.

Lineweaver-Burk plot
Figur 3. Lineweaver-Burk-ritning.