Metoder, tekniker och protokoll för immunocytokemi

ICC:s huvudsida > Cellfixering

För att säkerställa att antikroppen får fri tillgång till antigenet måste cellerna fixeras och permeabiliseras. I allmänhet är fixeringsstyrkor och fixeringstider betydligt kortare för celler än för tjockare, strukturellt komplexa vävnadssektioner. För immunocytokemi innebär provberedningen i huvudsak att målcellerna fixeras på objektglaset. En perfekt fixering skulle göra antigenerna fastlåsta, samtidigt som den autentiska cellulära och subcellulära arkitekturen bibehålls och antikropparna får obehindrad tillgång till alla celler och subcellulära avdelningar. Ett stort antal olika fixeringsmedel används vanligen, och det korrekta valet av metod beror på arten av det antigen som undersöks och på egenskaperna hos den antikropp som används. Fixeringsmetoderna kan i allmänhet delas in i två klasser: organiska lösningsmedel och tvärbindningsreagenser. Organiska lösningsmedel som alkoholer och aceton avlägsnar lipider och dehydrerar cellerna, samtidigt som de fäller ut proteinerna på cellstrukturen. Tvärbindningsreagens (t.ex. paraformaldehyd) bildar intermolekylära broar, normalt genom fria aminogrupper, och skapar på så sätt ett nätverk av sammanlänkade antigener. Tvärbindningsreagenserna bevarar cellstrukturen bättre än organiska lösningsmedel, men kan minska antigeniciteten hos vissa cellkomponenter och kräver att man lägger till ett permeabiliseringssteg för att antikroppen skall kunna komma åt provet. Fixering med båda metoderna kan denaturera proteinantigen, och av denna anledning kan antikroppar som framställts mot denaturerade proteiner vara mer användbara för färgning av celler. Olika fixeringsmetoder beskrivs. Den lämpliga fixeringsmetoden bör väljas beroende på den aktuella tillämpningen.

1. Acetonfixering

  • Fixera celler i aceton vid -20°C i 5-10 minuter.

  • Ingen permeabiliseringssteg behövs efter acetonfixering.

2. Metanolfixering

  • Fixera celler i metanol vid -20°C i 5-10 minuter.

  • Ingen permeabiliseringssteg behövs efter metanolfixering.

3. Etanolfixering

  • Fixera celler i nedkyld 95 % etanol, 5 % isättika i 5-10 minuter.

4. Metanol-acetonfixering

  • Fixera i kyld metanol, 10 minuter vid -20 °C.

  • Ta bort överflödig metanol.

  • Permeabilisera med kylt aceton i 1 minut vid -20 °C.

5. Metanol-Aceton-blandning Fixering

  • 1:1 metanol- och acetonblandning.

  • Förbered blandningen på nytt och fixera cellerna vid -20 C i 5-10 minuter.

6. Fixering med metanol-etanolblandning

  • 1:1 blandning av metanol och etanol.

  • Gör blandningen ny och fixera cellerna vid -20 C i 5-10 minuter.

7. Formalinfixering

  • Fixera celler i 10 % neutralt buffrat formalin i 5-10 minuter.

  • Skölj kort med PBS.

  • Permeabilisera med 0,5 % Triton X-100 i 10 minuter.

8. Paraformaldehyd-Tritonfixering

  • Fixera i 3-4 % paraformaldehyd i 10-20 minuter.

  • Skölj kort med PBS.

  • Permeabilisera med 0,5 % Triton X-100 i 10 minuter.

9. Paraformaldehyd-metanolfixering

  • Fixera i 4 % paraformaldehyd i 10-20 minuter.

  • Skölj kort med PBS.

  • Permeabilisera med kyld metanol i 5-10 minuter vid -20 °C.