Resultat och diskussion

Övergripande TE-domänstruktur. Även om strukturen för den isolerade TE-domänen som löstes representerar två oberoende molekyler (1 och 2) i den asymmetriska enheten (tabell 1), renades domänen och var fullt aktiv som en monomer (Z.G. och B.C., opublicerade uppgifter). Nativ mänsklig FAS är arrangerad som en head-to-tail antiparallellel homodimer (1), vilket nyligen visualiserades i kartor för elektronkryomikroskopi (cryo-EM) (31). Detta arrangemang skulle placera de två TE-domänerna i FAS-monomererna i motsatta ändar från varandra, vilket inte ger någon funktionell relevans för bildandet av en dimer. Av dessa skäl är dimern en artefakt från kristalliseringen. Strukturen av molekyl 1 betraktas nedan som en representant för strukturen.

TE-domänen för humant FAS består av två subdomäner (A och B) (fig. 1). Den större subdomänen A (≈23 kDa) består av två icke sammanhängande segment från de amino- (eller N-) och karboxyl- (eller C-) terminala ändarna (fig. 1, 2, 3). Det mellanliggande segmentet är hänfört till den mindre (≈9 kDa) subdomän B. Subdomän A har ett övergripande α/β-veck, medan subdomän B har ett helt α-helikalt motiv. Hela strukturen består av nio α-helixer och åtta β-strängar (fig. 1 och 2). Större delen av hela TE-domänstrukturen kunde passas in i elektrontätheten, med undantag för de tre segmenten och en glycinrest som visas i figurerna 1, 2 och 3, med saknad eller svag täthet, vilket tyder på deras höga rörlighet. Alla de oordnade segmenten finns i områden som är exponerade för lösningsmedel och är inte i närheten av att vara involverade i kristallkontakter.

De tre katalytiska resterna i den humana FAS TE:n (Ser-2308, His-2481 och Asp-2338) är kopplade till varandra och till de angränsande resterna genom ett omfattande vätebindningsnätverk (fig. 4). Ser-2308:s hydroxylgrupp är involverad i en kooperativ vätebindning som tar emot från Tyr-2309:s intilliggande amidryggrad och donerar till Nε2 av His-2481. Detta skulle i sin tur underlätta aktiveringen av Ser-2308 som nukleofil och bidra till att stabilisera den tetraederformiga mellanprodukt för oxyanjoner som förväntas bildas under den katalytiska TE-reaktionen, vilket ses i serinhydrolaser. His-2481-restigen (Nε2) är i sin tur vätebunden till Asp-2338 (Oδ2). Asp-2338 (Oδ1-atom) gör ytterligare vätebindningar med både Ala-2448:s amid i ryggraden och Tyr-2462:s hydroxylgrupp. Tyr-2462 är helt invariant, medan Ala-2448 är delvis bevarad från insekter till däggdjur (fig. 3). Interaktionen mellan dessa rester och den katalytiska aspartatresterna verkar alltså vara viktig för att hålla Asp-2338 fixerad i sin speciella position, vilket ytterligare visar på den viktiga roll som denna rest spelar. Det omfattande vätebindningsnätverket vid den katalytiska platsen håller enzymet redo att verka genom att orientera och placera de katalytiska resterna i de positioner som krävs, ungefär som i serinhydrolaser (40).

Palmitoylkedjebindningsställe och kedjelängdsspecificitet. För att få en förståelse för den mekanism genom vilken FAS:s TE-domän reglerar kedjelängdsspecificiteten, analyserade vi TE-strukturen för att se om det fanns ett spår nära det katalytiska centret som skulle kunna rymma substrat med långa fettacylkedjor. Förekomsten av endast ett spår är uppenbar, som är beläget vid gränssnittet mellan subdomänerna A och B (fig. 5). Analyser med hjälp av proshape (se Material och metoder) bekräftade närvaron av spåret med en volym på 186,9 Å3 och en yta på 140 Å2, vars distala ände bildar en ficka (fig. 5). Spåret ligger nära TE-domänens aminoterminus, som är kopplad till FAS ACP-domänen som håller de växande acylkedjorna för skanning och frisättning av TE-domänen efter att ha nått den optimala längden på 16 kolfettsyror i fettsyrekedjan. De flesta av de rester som kantar spåret har sitt ursprung i den ampifila helixen α8 i subdomän B. Andra rester som bidrar till det kommer från helix α5 i subdomän B, den N-terminala helixen α1 i subdomän A och slingan mellan β2 och α2 i subdomän A. Resterna som kantar spåret, som mestadels är hydrofoba till sin natur, består av Phe-2418, Ala-2419, Ser-2422, Phe-2423 och Lys-2426 från helix α8, Phe-2370 och Phe-2371 från helix α5, Leu-2222, Leu-2223 och Val-2224 från helix α1 samt Ile-2250 och Glu-2251 från slingan mellan β2 och α2 (fig. 5A ). Av dessa rester är Ile-2250, Glu-2251 och Lys-2426 invarianta mellan olika arter, medan Val-2224, Phe-2371, Ala-2419 och Phe-2423 är mestadels konserverade (fig. 3). Resten av resterna är helt konserverade hos däggdjur (fig. 3). Alla ovanstående observationer sammantaget tyder på att gränssnittet mellan de två subdomänerna är en utmärkt fettsyrekedjebindningsregion. Två experiment genomfördes för att ge trovärdighet åt förslaget och för att få en inblick i fettacylkedjeselektiviteten.

Fig. 5.

Lipidbindningsplats. (A) Stereovisning av kandidatpalmitoylbindningsrännan för de första 11-12 kolvätena och fickan för de sista 5-4 kolvätena. Hexadecylsulfonylhämmaren representeras som en Corey-Pauling-Koltun-rumsfyllnadsmodell (C, gul; O, röd; S, grön). Sidokedjor som kantar spåret visas som bollfigurer (C, gul; O, röd; N, blå). De sidokedjor som utgör den aktiva platsen visas också som boll- och stavfigurer med en färgskala som liknar den för resterna. Kartan över spårytan visas i grönt trådnät. Resterna som utgör spåret är märkta med undantag för Ile-2250, som inte kan ses eftersom den ligger under inhibitorn. De inledande 11-12 kolatomerna från sulfonylgruppen är lösningsmedelsexponerade med den 11:e och 12:e kolatomen vid fickans mynning. (B) En annan vy av spåret och fickan. Pilarna anger rotationerna från orienteringen av bilden i A till B. Denna bild visar att större delen av hexadecylinhibitorens fettacylkedja är exponerad för lösningsmedlet.

För det första visade vi genom platsstyrd mutagenes att utbyten av flera av de rester som kantar spåren och fickan i TE-domänen minskade TE-aktiviteten, även om det skedde i olika omfattning (tabell 2).

Visa denna tabell:

  • Se inline
  • Se popup

Tabell 2. Mutationer i kandidatbindningsrännan minskar aktiviteten hos TE

För det andra kunde vi modellera bindningen av en C16 palmitoylkedjeinnehållande hämmare hexadecylsulfonyl f luorid (HDSF) i rännan. Modelleringen styrdes av data från kristallstrukturen av palmitoylprotein TE 1 (PPT1) med kovalent bunden hexadecylsulfonat (HDS) (PDB ID-kod 1exw; ref. 41) och utökades genom energiminimering i cns. Liksom TE innehåller den katalytiska platsen för PPT1 en konserverad katalytisk triad av serin, histidin och aspartat. Strukturen för PPT1-HDS-komplexet visade bildandet av den kovalenta bindningen mellan svavelatomen i HDS och syreatomen i det katalytiska serinet och närvaron av fettacylkedjan i ett långt, mestadels hydrofobt ytspår i proteinet (41). Den modellerade kovalent bundna HDS i TE-strukturen (visas i fig. 5) avslöjade flera egenskaper hos ligandbindningen med viktiga funktionella och biokemiska implikationer. Anpassningen av HDS orsakade inga större omarrangemang av resterna i bindningsstället. Palmitoylkedjan gör en skarp böjning i förhållande till sulfonatgruppen på ett liknande sätt som i den bundna PPT1-strukturen. Palmitoylkedjan med 16 kolatomer passar väl in i spåret med de första ≈12 kolatomerna exponerade för lösningsmedlet och de återstående ≈4 kolatomerna insatta och hållna på plats i den distala fickan. Denna inpassning är helt förenlig med observationen att däggdjurs FAS TE katalyserar bildandet av palmitinsyra som sin huvudprodukt (20). Närvaron av de sista ≈4 kolatomerna i fickan hjälper till att binda fettsyrekedjan på plats för hydrolysen av palmitoylacylsubstratet. Bindningsställets beskaffenhet, som kombinerar ett exponerat spår med en sluten ficka, är unik och utformad för denna TE:s specificitet. Upptäckten att TE-domänen hos FAS från däggdjur inte visar någon signifikant aktivitet mot fettacylkedjelängder som är kortare än 14 kolatomer (20) kan förklaras av icke-produktiv bindning på grund av avsaknaden av tethering och den resulterande större rörligheten hos de exponerade kortare kedjorna. De sista ≈4 kolatomerna i palmitoylkedjan upptar delvis den distala fickan, vilket lämnar tillräckligt med utrymme för att rymma endast 2 ytterligare kolatomer. Detta resultat stämmer överens med den dramatiska förlust av aktivitet som man sett med modellsubstrat som är längre än 18 kolatomer (20). Det är oklart om de sista ≈4 och ≈6 kolatomerna i C16- respektive C18-fettacylkedjorna kommer att infogas i en förformad ficka mellan de två subdomänerna, vilket ses i strukturen för den obundna formen, eller om de kommer att vara bundna initialt till en öppen form av domänen som sedan senare genomgår en gångjärnsböjningsrörelse mellan subdomänerna för att innesluta de terminala kolatomerna i fettacylkedjorna och skapa den produktiva konfigurationen av regionen med den aktiva platsen.

Ansevärda ansträngningar gjordes för att kristallisera TE med olika analoger av långkedjiga fettsyror (t.ex, palmitoyl-CoA, myristoyl-CoA, stearoyl-CoA, palmitinsyra, hexadecylsulfonylfluorid och palmitinsyra), men inga långlivade stabila komplexa strukturer hittades. De flesta komplexen, vilket visades genom oberoende enzymaktivitets- eller radioaktiva bindningsanalyser i lösning, dissocierades inom 5 minuter till 1 timme, vilket gjorde dem olämpliga för kristallisering eller försök med kristallinblötläggning.

Cryo-EM Fit of TE Structure. Även om den 20-Å cryo-EM rekonstruktionsstrukturen av mänsklig FAS-dimer har beskrivits (31), fanns det ingen indikation på den N- till C-terminala polariteten hos FAS-underenheten förutom en tidigare indikation från antikroppsmärkning att FAS TE-domänen var belägen vid en av ändarna av hela strukturen (42). Vi försökte göra en preliminär bedömning av polariteten genom att manuellt docka den mindre (32 kDa) humana FAS TE-domänstrukturen, som upptar den C-terminala änden av FAS-underenheten, och den större (42 kDa) E. coli β-ketoacylsyntas I (eller KSI) kristallstruktur (PDB ID-kod 1ek4) (43), som är en nära homolog till den N-terminala KS-domänen i däggdjurs FAS, i varje ände av monomerenheten som betecknas som huvud och fot i cryo-EM-massatätheten (fig. 6). TE-strukturen passar väl in i spetsen av den substruktur som betecknas fot, medan KSI passar bäst in i spetsen av den substruktur som betecknas huvud (fig. 6). I FAS-dimeren interagerar ACP-domänen med både TE-domänen i samma monomer och ketoacylsyntasdomänen i den motsatta monomeren, vilket leder till att det bildas två aktiva centra i dimerens båda ändar. Orienteringen av TE-domänen och KS-domänens homolog för bästa anpassning vid foten respektive huvudet rymde både utrymme och funktionell interaktion mellan ACP-molekylen och båda proteinerna. När strukturerna byttes ut var anpassningen mycket sämre, med vissa delar av KSI som föll utanför tätheten och en större volym av oräknad täthet i TE-anpassningen (fig. 6).

Fig. 6.

Förberedande anpassning av TE (grönt ryggradsspår) och KSI (rödbrun spår) i 20-Å-upplösningen kryo-EM massatäthet. De understrukturer som syns i densiteten betecknas som huvud, torso och fot. TE-spåret passar bäst i den substruktur som kallas Fot, medan KSI-spåret passar bäst i den substruktur som kallas Huvud. Den bästa anpassningen för både KSI och TE är inringad i rött. Spåren för TE och KSI i botten av masstätheten visar mindre tillfredsställande anpassningar i huvudet respektive foten. Baserat på tidigare proteolytiska digestionsexperiment av intakt FAS identifierades tre domäner: domän I, som omfattar KS-AT/MT-DH-enzymcentren och länkregionen; domän II, som omfattar ER-KR-ACP-regionen; och domän III, som tilldelas TE (1, 2). Substrukturerna Head och Torso, som i huvudsak är sammanfogade, skulle kunna motsvara domän I och delar av domän II, och foten skulle kunna representera resten av domän II och domän III.

Slutsatser. De viktigaste slutsatserna som kan dras från kristallstrukturen av TE-domänen av mänsklig FAS är följande. (i) TE består av två subdomäner som skiljer sig åt i storlek och vikningsmotiv. (ii) Den större A-subdomänen uppvisar ett α/β-motiv, medan den mindre B-subdomänen är helt spiralformad. (iii) Subdomän A bidrar med den katalytiska triaden av Ser-, Asp- och His-rester. (iv) Det långa spåret med en distal ficka mellan subdomän B och delar av subdomän A utgör bindningsstället för fettacylkedjan. Geometrin och arten av denna plats överensstämmer med TE:s höga specificitet för C16- till C18-fettacylsubstrat. Spåret fungerar som en linjal som mäter rätt substratlängd. (v) Den preliminära inpassningen av TE i den intakta mänskliga FAS cryo-EM-strukturen tyder på en plausibel N- till C-terminuspolaritet hos underenheterna. Det behövs dock en cryo-EM-mappning med högre upplösning för ytterligare verifiering av anpassningen och en djupgående analys av FAS-funktionen.