En jämförelse mellan immunohistokemi och Western Blot

Av Sarah Moore, M.Sc.Recenserad av Michael Greenwood, M.Sc.

Immunohistokemi och Western Blot fungerar båda genom att utnyttja principen om hur antikroppar binder sig specifikt till antigener som finns i biologisk vävnad.

Bildkredit: Sinitar/.com

Immunohistokemi är den vanligaste immunfärgningstekniken. Den visualiserar förekomsten av målinriktade antigener i ett vävnadsprov genom att använda antikroppar som fäster sig vid antigenerna, har en katalytisk effekt och delar upp molekylen i identifierbara föreningar. Visualisering av denna interaktion kan åstadkommas genom att använda ett enzym (som ger en kromogen signal) eller en fluorofor (som ger en fluorescerande signal).

Western blot fungerar enligt samma princip. Det rapporterades för första gången på 1970-talet när forskare först använde det för att framgångsrikt klassificera olika proteiner som finns i biologisk vävnad. Sedan dess har betydande framsteg gjorts inom tekniken, vilket har lett till att den moderna fluorescerande, kolorimetriska och kemiluminescerande Western blot-tekniken har etablerats.

Alla versioner av Western blot-metoden bygger på hur antigen-antikroppskomplexet fungerar för att identifiera specifika proteiner som finns i ett prov, vilket indikeras av antingen enzym-substratreaktionerna hos kolorimetriska, kemiluminescerande eller fluorescerande molekyler. Det ljus som produceras av dessa källor kan användas för att härleda närvaron och koncentrationen av proteinerna i ett prov.

Vid jämförelse av teknikerna

Men även om de två metoderna bygger på principen om interaktion mellan antikropp och antigen finns det några stora skillnader mellan de två teknikerna. Nedan redogör vi för detta, steg för steg.

För det första måste provet förberedas korrekt för båda teknikerna. Förberedelsen skiljer sig ganska mycket åt mellan de två. För immunohistokemi skärs vävnadsproverna i skivor eller lämnas hela, beroende på deras storlek.

Gränsen för provernas storlek ligger i allmänhet mellan 3 µm och 5 µm. Därefter bäddas proverna in i ett medium, vanligen paraffinvax eller cryomedia. Därefter placeras skivorna på objektglas och dehydreras med hjälp av alkoholtvättar med ökande styrka och avslutas slutligen med att ett tvättmedel tillsätts för att rensa provet, vilket gör det redo att betraktas i ett mikroskop.

Det krävs å andra sidan för Western blot att proverna först separeras genom elektrofores och sedan immobiliseras i ett blottingmembran.

Metoden för färgning av proverna skiljer sig också något mellan de två teknikerna. Immunohistokemi tillför antingen polyklonala eller monoklonala antikroppar. Dessa antikroppar klassificeras som antingen primära eller sekundära reagenser, de första är de som är uppförda mot ett målantigen och är vanligtvis okonjugerade, de senare är konjugerade till en länkmolekyl som sedan rekryterar reportermolekyler.

Den konjugerade versionen används i en direkt färgningsmetod, där antikroppen reagerar direkt med antigenet i provet, den okonjugerade versionen används i en indirekt färgningsmetod där den omärkta antikroppen binder till målantigenet i vävnaden, vilket får en sekundär antikropp att reagera med den primära antikroppen.

I jämförelse med Western blot-metoden tillsätts ett fluorescerande färgämne till provet, följt av exponering för en ljuskälla med lämplig våglängd för att excitera molekylerna i fluoroforerna.

Efter en viss tid släpper de exciterade fluoroforerna så småningom den energi som de fått från ljuskällan och återgår till sitt grundtillstånd. Det är denna frisättning av energi som gör att fluorhorerna fluorescerar och avger en ljuskälla som kan fångas av ett digitalt bildsystem.

Varför fördelar och nackdelar

Den största fördelen med immunohistokemi är att metoden gör det möjligt för forskarna att detektera den exakta placeringen av ett målprotein i ett vävnadsprov. Denna huvudfördel har lett till att den har blivit väl etablerad inom neurovetenskapen som en robust metod för att undersöka proteinuttryck på målpunkter i hjärnan.

Å andra sidan har metoden en stor nackdel jämfört med Western blot-metoden. Detta är det faktum att färgningarna inte kontrolleras mot en molekylviktstrappa, vilket de gör i Western blot, vilket innebär att det inte finns något sätt att bevisa att den färgning som visas i immunohistokemi är slutgiltigt relaterad till ett specifikt protein.

Den indirekta metoden för immunohistokemi är erkänd för att vara mycket känslig, men den direkta metoden är känd för att vara tvärtom och är i allmänhet oförmögen att upptäcka små koncentrationer av målantigen.

Western blot-metoden är fördelaktig genom att den har etablerat sig som en tillförlitlig teknik för att samla in kvantitativa data. Dess mest framträdande fördel är dock att den har visat sig vara effektiv när det gäller att generera en signal som är proportionell mot mängden av proteinet som finns i provet.

Också Western blot väljs ofta för sin förmåga att detektera många målproteiner samtidigt, vilket har som effekt att det avsevärt minskar testtiden samt minskar antalet resurser som krävs.

En skillnad i tillämpningar

Det finns en stor överlappning i tillämpningarna av de två teknikerna med tanke på att de är så lika. Överlag förlitar man sig dock mest på immunohistokemi som ett diagnostiskt verktyg för många cancerformer.

Metoden används för att identifiera onormala celler som är karakteristiska för vissa tumörer. Metoden används också i stor utsträckning för att identifiera och lokalisera proteiner och biomarkörer som finns i både normala och sjuka vävnader. Slutligen används den också ofta för att upptäcka många infektiösa organismer i vävnader.

Vid jämförelse används Western blot främst för att upptäcka autoimmuna sjukdomar, allergier och infektionssjukdomar. Den används ofta inom områdena molekylärbiologi, biokemi och cellbiologi, och dess mest anmärkningsvärda tillämpningar används som ett diagnostiskt verktyg för hiv och BSE.

Fortsatt läsning

• Allt innehåll om immunohistokemi
• Immunohistokemi (IHC) Avbildningstekniker
• Enzymatisk immunohistokemi (IHC)
• Multifärgad immunohistokemi (IHC)
• Hur fungerar immunokemi?

Skrivet av

Sarah Moore

Efter att ha studerat psykologi och sedan neurovetenskap upptäckte Sarah snabbt att hon tyckte det var roligt att forska och skriva forskningsrapporter.

Citat

.