Doxycyklin är antiinflammatoriskt och hämmar stafylokockexotoxin-Inducerade cytokiner och kemokiner

Stafylokockers toxiska chocksyndromtoxin 1 (TSST-1) och de strukturellt besläktade exotoxinerna är bakteriella exotoxiner som binder direkt till stora histokompatibilitetskomplexets klass II-molekyler på antigenpresenterande celler (1, 5, 8, 18, 23) och aktiverar T-celler som uttrycker specifika Vβ-element (7). Dessa toxiner kallas superantigener på grund av deras förmåga att polyklonalt stimulera stora populationer av T-celler (1, 4, 7, 14). Stafylokockexotoxiner (SE) är således potenta aktivatorer av immunsystemet och orsakar en rad olika sjukdomar hos människor, bland annat matförgiftning, toxisk chock och autoimmuna sjukdomar (1, 2, 6, 12, 14, 22). Deras interaktion med celler i immunsystemet resulterar i en massiv produktion av proinflammatoriska cytokiner och kemokiner (1, 4, 15, 17). Cytokinerna tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α), interleukin-1 (IL-1) och gammainterferon (IFN-γ) är viktiga mediatorer vid superantigeninducerad toxisk chock (1, 21). Både TNF-α och IL-1 har potenta immunstimulerande aktiviteter och verkar synergistiskt med IFN-γ för att förstärka immunreaktioner och främja vävnadsskador (16). Följaktligen är dessa cytokiner patogena vid höga koncentrationer in vivo och är ansvariga för feber och toxisk chock inducerad av SE (13, 14, 18, 19).

Doxycyklin är ett bredspektrumantibiotikum som används i stor utsträckning för infektioner orsakade av både gramnegativa och grampositiva mikroorganismer. Det fungerar som ett bakteriostatiskt medel och är mycket effektivt mot många mikroorganismer, inklusive Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Bacillus anthracis och Yersinia pestis. Doxycyklin tillhör familjen tetracyklinantibiotika, vars medlemmar har visat sig ha andra biologiska verkningar som är oberoende av deras antimikrobiella effekter (10). Doxycyklin hämmar det genom phorbol-12-myristat-13-acetat medierade matrixmetalloproteinas 8 (MMP-8) och MMP-9 i humana endotelceller (11). Doxycyklin minskar också elastinnedbrytningen och minskar MMP-aktiviteten i en modell av aneurism (3). Nyligen visade sig doxycyklin hämma produktionen av IL-1β i lipopolysackaridbehandlade hornhinneepitelkulturer i en omfattning som är jämförbar med den som uppnås med kortikosteroider (25). In vivo skyddade doxycyklin möss från dödlig endotoxemi genom att nedreglera cytokin- och nitratutsöndringen i blodet (20). Denna studie genomfördes för att fastställa den modulerande effekten av doxycyklin på stafylokocks superantigeninducerad T-cellsaktivering och cytokinproduktion från mänskliga mononukleära celler i perifert blod (PBMC).

Humana PBMC isolerades genom Ficoll-Hypaque-densitetsgradientcentrifugering av hepariniserat blod från normala mänskliga donatorer. PBMC (106/ml) odlades vid 37 °C i 24-hålsplattor som innehöll RPMI 1640-medium och 10 % värmeinaktiverat fetalt bovint serum. Cellerna inkuberades med antingen SEB (200 ng/ml) eller TSST-1 (200 ng/ml) i 16 timmar, och supernatanterna skördades och analyserades för IL-1β, TNF-α, IL-6, IFN-γ, MCP-1, MIP-1α och MIP-1β. Cytokiner och kemokiner mättes med en enzymbunden immunosorbentanalys med cytokin- eller kemokinspecifika antikroppar i enlighet med tillverkarens anvisningar (15, 17). Humana rekombinanta cytokiner och kemokiner (20 till 1 000 pg/ml) användes som standarder för kalibrering på varje platta. Detektionsgränsen för varje analys var 20 pg/ml. Cytokin- och kemokindata uttrycktes som medelvärdet ± standardavvikelsen (SD) för dubbla prover. Doxycyklin, i förekommande fall, tillsattes samtidigt med det stimulerande medlet. Cytotoxicitet mättes genom frisättning av laktatdehydrogenas (LDH) från cytosolen i kultursupernatanten. LDH kvantifierades med hjälp av ett kolorimetriskt testkit för cytotoxicitet (Boehringer Mannheim) enligt tillverkarens anvisningar. Den maximala mängden av frigörbart LDH (100 %) erhölls genom att lysera cellerna med 1 % Triton X-100. T-cellernas proliferation testades med PBMC (105/brunn), som pläterades i tre exemplar med SEB eller TSST-1 (200 ng/ml), med eller utan doxycyklin, i 48 timmar vid 37 °C i 96-håls-mikrotiterplattor. Cellerna pulserades med 1 μCi tymidin (New England Nuclear, Boston, Mass.) per brunn under de sista 5 timmarna av odlingen enligt tidigare beskrivning (15). Cellerna skördades på glasfiberfilter och inkorporerat tymidin mättes med hjälp av vätskescintillation. Alla data analyserades med avseende på signifikanta skillnader genom Student’s t-test med Stata (Stata Corp., College Station, Tex.). Skillnader mellan doxycyklinbehandlade och obehandlade kontrollgrupper ansågs vara signifikanta om P var <0,05.

Med utgångspunkt i rapporten om att doxycyklin blockerade lipopolysackaridinducerat IL-1 i epitelceller och förhindrade dödlig endotoxemi in vivo (20, 25) testade vi hypotesen att detta antibiotikum skulle kunna ha direkta effekter på SE-inducerade cytokiner. Som framgår av fig. 1 hämmade doxycyklin dosberoende produktionen av cytokinerna IL-1β, IL-6, TNF-α och IFN-γ och kemokinerna MCP-1, MIP-1α och MIP-1β av PBMC som inkuberades med SEB. En liknande dosberoende minskning av cytokiner och kemokiner med doxycyklin observerades också för TSST-1-stimulerade PBMC (data visas inte). Den hämmande effekten av doxycyklin på SEB- eller TSST-1-medierade cytokiner och kemokiner som erhållits med PBMC från sju normala donatorer sammanfattas i fig. 2. Produktionen av MCP-1 och IFN-γ blockerades helt av 50 μM doxycyklin. Denna koncentration av doxycyklin minskade IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP-1α och MIP-1β till 15-22 %, 37-41 %, 21-25 %, 10-15 % och 59-61 % jämfört med obehandlade, SEB- eller TSST-stimulerade celler respektive. TNF-β, när det förekom, hämmades också till 25 % av värdet för obehandlade, SEB-stimulerade celler. Doxycyklin var inte cytotoxiskt för PBMC vid denna koncentration, vilket mäts genom uteslutning av trypanblått och avsaknad av frisättning av laktatdehydrogenas från behandlade celler. Fullständig hämning av dessa cytokiner och kemokiner observerades vid höga doser av doxycyklin (>0,1 mM). Liknande dosresponshämning av doxycyklin observerades vid lägre koncentrationer av SEB (1 och 10 ng/ml) (data visas inte).

Då superantigener också orsakar T-cellproliferation undersöktes effekten av doxycyklin på SE-inducerad T-cellproliferation. Figur 3 visar att doxycyklin hämmade SEB- och TSST-1-stimulerad T-cellsproliferation på ett dosberoende sätt och uppnådde 98 % hämning vid 0,05 mM.

Denna studie visade att doxycyklin effektivt hämmade superantigenmedierad produktion av cytokiner och kemokiner av humana PBMC in vitro. T-cellsproliferation inducerad av stafylokock superantigener undertrycktes också fullständigt. Nedreglering av proinflammatoriska cytokiner och kemokiner av doxycyklin i SEB- och TSST-1-stimulerade PBMC tyder på att doxycyklin kan påverka patofysiologin vid toxisk chock. Dessa resultat utvidgar andra forskares observationer av de immunmodulerande effekterna av doxycyklin utöver dess antimikrobiella aktiviteter.

Mångfaldiga molekylära mekanismer, både transkriptionella och posttranskriptionella, kan vara inblandade i de antiinflammatoriska effekterna av doxycyklin (11, 26). Undertrycket av proinflammatoriska cytokiner kan inbegripa nedreglering av PKC-vägen av doxycyklin, vilket antyds av en studie av dess effekter på granulombildning (26). Den rapporterade hämmande dosen av doxycyklin (10 till 15 μM) som minskar kollagenas, gelatinas och andra metalloproteinaser in vitro (10, 11) är jämförbar med den som användes i denna studie och är flera gånger högre än den som observeras i humant serum efter oral dosering av 200 mg dagligen (10, 24). Kliniska studier visar dock att denna dos var tillräcklig för att minska kollagenas- och gelatinasaktiviteterna i humana osteoartritiska broskutdrag ex vivo (24). En subantimikrobiell dos av doxycyklin (20 mg två gånger dagligen) har visat sig hämma gingivavätskans kollagenasaktivitet (9). Dessutom har man i in vivo-studier av experimentell endotoxemi också funnit att doxycyklin och andra tetracykliner är effektiva när det gäller att nedreglera inflammatoriska cytokiner och förebygga chock (20).

Slutsatsen är att de resultat som presenteras här tyder på att doxycyklin nedreglerar proinflammatoriska cytokiner och kemokiner, vilket tyder på att det kan vara användbart för att behandla superantigeninducerad toxisk chock. I en klinisk miljö där värden utsätts för flera biologiska agenser, inklusive både bakterier och bakteriella exotoxiner, erbjuder användningen av doxycyklin en ytterligare fördel genom att ge både antimikrobiella och antiinflammatoriska effekter.