ARTIGOO ORIGINAL / ORIGINAL ARTIKEL

DIAGNOSIS AV ALPHA-1-ANTITRYPSINBRISTELSE GENOM DNA-ANALYS AV BARN MED LEVERSEKTION*

Adriana Maria Alves De TOMMASO1, Cláudio Lúcio ROSSI2, Cecília Amélia Fazzio ESCANHOELA3, Heliane Guerra SERRA4, Carmen Sílvia BERTUZZO5 och Gabriel HESSEL6

ABSTRACT ¾ Bakgrund – Alfa-1-antitrypsinbrist är en genetisk sjukdom som överförs i en co-dominant, autosomal form. Alfa-1-antitrypsinbrist drabbar främst lungorna och levern och leder i det senare fallet till neonatal kolestasis, kronisk hepatit eller cirros. En exakt diagnos av alfa-1-antitrypsinbrist kan erhållas genom biokemisk eller molekylär analys. Syfte – Syftet med denna studie var att med hjälp av DNA-analys undersöka förekomsten av alfa-1-antitrypsinbrist hos 12 barn som misstänktes ha denna brist och som uppvisade laboratorie- och kliniska kännetecken för sjukdomen. Patienter och metoder – Tolv patienter i åldrarna 3 månader till 19 år som hade serumnivåer av alfa-1-antitrypsin som var lägre än normalt och/eller hade en leversjukdom av odefinierad etiologi undersöktes. De muterade allelerna S och Z i alfa-1-antitrypsingenen undersöktes hos de tolv barnen. Alpha-1-antitrypsin-genens organisation analyserades genom amplifiering av genoma genom polymeraskedjereaktion och digestion med restriktionsenzymerna Xmnl (S-allel) och Taq 1 (Z-allel). Resultat – Sju av de 12 patienterna hade kronisk leversjukdom av odefinierad etiologi och de övriga fem patienterna hade låga serumnivåer av alfa-1-antitrypsin samt en diagnos av neonatal kolestas och/eller kronisk leversjukdom av odefinierad etiologi. Fem av de tolv patienterna var homozygota för Z-allelen (ZZ) och två hade S-allelen med en annan allel (*S) som skiljer sig från Z. Slutsats – Dessa resultat visar att alfa-1-antitrypsinbrist är relativt vanligt förekommande hos barn med kronisk leversjukdom av odefinierad etiologi och/eller låga alfa-1-antitrypsinnivåer (41,6 %). En korrekt diagnos är viktig för en effektiv klinisk uppföljning och för genetisk rådgivning.

HÄLSAKTIONER ¾ Alfa-1-antitrypsinbrist. Molekylär diagnos. Leverbiopsi.

INLEDNING

Alpha-1-antitrypsin (A1AT) är ett 52 kDa-glykoprotein som huvudsakligen produceras av hepatocyter som släpper ut 2 g av detta protein, per dag, i blodet(36). A1AT:s huvudsakliga funktion är att hämma verkan av neutrofilt elastas, ett serinproteas som hydrolyserar elastinfibrer i lungorna(38). Mutationer i den gen som kodar för A1AT ger ett protein utan hämmande förmåga och kan leda till att A1AT ackumuleras i inklusionskroppar i hepatocyter, vilket minskar de normala serumnivåerna av detta protein(4). Denna brist återspeglas som lungemfysem, kronisk bronkit eller bronkiektasi(9). Ackumulering av mutant A1AT i hepatocyter kan också leda till neonatal kolestas, kronisk hepatopati eller cirros(33, 34).

A1AT-genen är mycket polymorf, co-dominant och ligger på den längre armen av kromosom 14 (14q 31-32.3)(20, 29). Sjutti¾ fem alleler (betecknade A-Z acording to their isoeletric points) har beskrivits för denna gen baserat på isoelektrisk fokusering av serum mellan pH 4 (anod) och pH 5 (katod) i polyakrylamidgeler. De vanliga varianterna migrerar till mitten av gelen och tillhör därför M-familjen (”middle”). En bristfällig variant, som ursprungligen beskrevs av LAURELL och ERIKSSON 1963(21), migrerar mot katoden och benämns Z. En annan variant, som rör sig långsamt i gelen, benämns S(5). Detta polymorfa ”locus” är allmänt känt som Pi-systemet (proteashämmare). De flesta varianterna producerar A1AT i normal mängd och kvalitet(7, 8, 25). Vissa alleler, t.ex. varianterna S och Z, är dock förknippade med ett bristfälligt tillstånd som uppnår polymorfa frekvenser som kaukasiska populationer och fall av en nollallel där proteinproduktionen är helt frånvarande har rapporterats(10).

S-allelen beror på att adenin byts ut mot tiamin i genens exon III, vilket leder till att glutaminsyra i position 264 byts ut mot valin och att det följaktligen bildas en instabil proteinstruktur(10, 11, 19). Z-allelen är resultatet av att guanin i position 342 byts ut mot adenin i genens exon V och leder till att det bildas ett protein som samlas på den inre grova ytan av hepatocytens endoplasmatiska retikulum(6). Diagnosen av ett bristtillstånd ställs vanligen efter kvantifiering av serumnivåerna av proteinet tillsammans med den elektroforetiska profilen efter isoelektrisk fokusering(23, 37). En mer exakt diagnos kräver genanalys med hjälp av DNA-baserade tekniker(12, 14, 26).

Syftet med denna studie var att identifiera bärare av S- och Z-allelen hos patienter som misstänktes ha denna brist och som uppvisade laboratorie- och kliniska kännetecken för denna sjukdom.

Patienter och metoder

Patienter

Under perioden från februari 1988 till augusti 1997 remitterades ett stort antal patienter till den pediatriska gastroenterologiska avdelningen, State University of Campinas, Campinas, SP, Brasilien, för att utreda hepatiska sjukdomar. Av detta antal var det endast 12 patienter som inte uppvisade någon definitiv diagnos (negativa resultat för virushepatit, autoimmun hepatit och Wilsons sjukdom). Dessa patienter genomgick en molekylär analys av A1AT.

Metoder

1 ¾ Studieprotokoll

2 – Leverbiopsi

Perkutana leverbiopsier togs fram enligt MOWAT(24) med lokalbedövning hos patienter som fastat i minst 4 timmar, med venoklys och normal protrombinaktivitet. Det erhållna fragmentet placerades omedelbart i 10 % formalin och bearbetades sedan och färgades med hematoxylin-eosin, Massons trikrom, preussiskt blått och silverimpregnering av retikulumfibrerna. Särskild färgning erhölls med PAS (periodic acid-Schiff) följt av behandling med diastas. Om eosinofilliknande cytoplasmiska granuler kvarstod även efter användning av diastas ansågs det vara positivt för A1AT-brist.

3 – Molekylär analys

För att undersöka de muterade allelerna S och Z i A1AT gjordes en DNA-extraktion av perifera blodleukocyter enligt den metod som beskrivs av WOODHEAD et al.(39).

RESULTAT

Fem av de 12 undersökta barnen var Z-homozygoter (ZZ) medan två av barnen hade S-allelen tillsammans med en annan allel som inte var Z (*S). Tabell 1 visar patienternas ålder vid tidpunkten för blodprovstagningen och den indikation som användes för att besluta om efterföljande analys. Tre av patienterna uppvisade neonatal kolestasis som en första manifestation av kronisk hepatopati.

Tabell 2 visar serumnivåerna av ALT, AP, gGT, A1AT samt resultaten av den molekylära undersökningen och leverbiopsi.

De fem patienterna med ZZ-genotyp hade sänkta A1AT-nivåer i serum och leverbiopsin visade cirros (en), neonatal hepatit (två), brist på interlobulära gallgångar (en) och kronisk hepatit (en). I detta sista fall (FSP) sågs eosinofilliknande cytoplasmiska granuler i periportala hepatocyter efter färgning med HE och bekräftades bakifrån av PAS-positivitet och diastasresistens (figur 1). De två patienterna med neonatal kolestas (EKBA och RHBP) genomgick en leverbiopsi när de var 10 respektive 13 veckor gamla och visade eosinofila PAS-positiva, diastasresistenta globuler.

Figurerna 2 och 3 visar resultaten av amplifiering och digestion av S- respektive Z-allelen.

DISKUSSION

Alpha-1-antitrypsinbrist är en av de vanligaste genetiska sjukdomarna som leder till leversjukdom hos barn och det är den vanligaste genetiska sjukdomen som kräver levertransplantation(17, 28). A1AT-brist drabbar 1 av 1600-2000 nyfödda barn i Nordamerika och Nordeuropa(28, 31), men endast 10-15 % av befolkningen med denna brist utvecklar hepatiska sjukdomar(32, 33). Enligt en studie som publicerades av SVEGER 1988(33) utvecklar 11 % av patienterna med PIZZ-fenotypen ikterisk hepatit under neonatalperioden. I denna studie hade tre patienter som diagnostiserats med A1AT-brist neonatal kolestas och hos två av dessa ansågs kolestasen vara idiopatisk innan en definitiv diagnos av bristen fastställdes. Fem till 10 procent av de fall av idiopatisk neonatal hepatit som rapporterats i litteraturen orsakas av en A1AT-brist(3).

I fem studerade patienter med denna brist låg serumnivåerna av A1AT under den normala nedre gränsen. Detta test bekräftade dock inte absolut diagnosen av sjukdomen. Eftersom A1AT är ett protein i den akuta inflammatoriska fasen ökar dess syntes vid inflammatoriska/infektiösa tillstånd, neoplasi, graviditet och vid behandling med östrogener och kortikosteroider(16, 22). En minskning av serumnivåerna av A1AT förekommer vid respiratoriskt ångestsyndrom hos nyfödda, i den terminala fasen av leversvikt, vid cystisk fibros och i situationer med stor proteinförlust(15). Serumnivåerna i SZ-genotyper, som teoretiskt sett skulle kunna leda till leversjukdomar, är vanligtvis normala.

När neonatal kolestasis föreligger är det i grunden nödvändigt med en differentialdiagnos med extrahepatisk biliär atresi. Den kliniska anamnesen gör det möjligt att ställa en adekvat diagnos i 83 % av fallen(1) och det är nödvändigt med specifika undersökningar för att förbättra diagnosens noggrannhet. Bland dessa undersökningar är leverbiopsi av stor betydelse. De histopatologiska förändringar som ses i leverbiopsin hos patienter med A1AT-brist kan vara desamma som de som observeras vid idiopatisk neonatal hepatit eller vid extrahepatisk biliär atresi(24). Förekomsten av huvudsakligen periportala, intrahepatocystiska klumpar som är starkt PAS-positiva efter diastasedesutjämning är en användbar indikation på A1AT-brist(13, 18, 27). Det är dock svårt att identifiera dessa globuler före den 12:e veckan efter födseln(35). I den här studien hade patient EKBA globuler med ovanstående egenskaper i levervävnad vid 10 veckors ålder. Inga sådana globuler sågs hos patient JCI (13 veckor gammal). Dessa resultat tyder på att förekomsten av globuler bör undersökas med hjälp av specialfärgning i leverfragment som erhållits före 12 veckors ålder, även om ett negativt resultat inte utesluter möjligheten av A1AT-brist. Biokemisk analys användes inte i denna studie eftersom DNA-analys, som är mer exakt, var möjlig.

En A1AT-brist är relativt vanlig hos barn som har en hepatisk sjukdom av odefinierad etiologi. Denna diagnos är underskattad, troligen på grund av att oprecisa diagnostiska metoder används. Molekylär analys ger en mer exakt diagnos och kan också vara användbar vid genetisk rådgivning av patienter med hepatisk sjukdom av okänd etiologi.

De Tommaso AMA, Rossi CL, Escanhoela CAF, Serra HG, Bertuzzo CS, Hessel G. Diagnóstico da deficiência de alfa-1-antitripsina por estudo molecular em crianças com doença hepática. Arq Gastroenterol 2001;38(1):63-68.

RESUMO – Racional – A deficiência de alfa-1-antitripsina é uma doença genética transmitida de forma autossômica co-dominante. De vanligaste manifestationerna inkluderar akometiment i lungor och lever. Denna sista form av sjukdom kan vara kolestase neonatal, hepatite crônica eller cirrose. Definitiv diagnos ställs genom biokemisk analys av alfa-1-antitrypsin eller molekylär analys. Syfte – Undersöka, i en grupp på 12 barn med misstänkt brist på alfa-1-antitripsina, om det finns en förekomst av brist på DNA för en definitiv diagnos, samt om det finns en koppling mellan brist på alfa-1-antitripsina och de kliniska och laboratoriemässiga egenskaperna som är motstridiga. Kasuistik och metoder – Mutanta alleler S och Z i alfa-1-antitrypsingenen undersöktes hos 12 patienter i åldrarna 3 månader till 19 år, remitterade från den pediatriska gastroenterologiska öppenvårdskliniken vid Universidade Estadual de Campinas, SP, Brasilien, för att de uppvisade alfa-1-antitrypsinnivåer i serum som var lägre än normalt och/eller en hepatisk sjukdom utan definierad etiologi. DNA-analysen utfördes med hjälp av den modifierade genamplifieringsmetoden med polymeraskedjereaktion som skapar restriktionsställen för enzymerna Xmnl (S-allel) och Taq l (Z-allel). Resultat – Av de 12 patienterna hade 7 en kronisk leversjukdom utan definierad etiologi och de övriga 5 hade låga serumvärden av alfa-1-antitrypsin tillsammans med en diagnos av neonatal kolestas och/eller kronisk leversjukdom av okänd etiologi. I denna grupp av 12 patienter observerades fem homozygota Z-patienter (ZZ) och två hade S-allelen tillsammans med en annan allel som skiljer sig från Z (*S). Slutsats – Dessa resultat visar att A1AT-brist är en relativt vanlig etiologi hos barn med kronisk leversjukdom utan definierad etiologi och/eller låg A1AT-dosering i serum (41,6 %). Vikten av en säker diagnos av bristen är motiverad inte bara för den kliniska uppföljningen av patienten utan även för genetisk rådgivning.

DESCRITORER ¾ Alfa-1-antitrypsinbrist. Molekylär diagnostik. Leverbiopsi.

1. Alagille D. Kolestasier under de tre första levnadsmånaderna. Prog Liver Dis 1979;6:471-85.

2. Andresen BS, Knudsen I, Jensen PKA, Gregersen N. Två nya icke-radioaktiva polymeraskedjereaktionsbaserade analyser av torkade blodfläckar, genomiskt DNA eller hela celler för snabb och tillförlitlig detektion av Z- och S-mutationer i alfa-1-antitrypsingenen. Clin Chem 1992;38:2100-7.

5. Brantly M, Nukiwa T, Crystal RG. Molekylär grund för alfa-1-antitrypsinbrist. Am J Med 1988;84:13-31.

6. Carlson JA, Rogers RB, Sifers R. Ackumulation av PiZ alfa-1-antitrypsin orsakar leverskador hos transgena möss. J Clin Invest 1989;83:1183-90.

8. Cox DW, Woo SL, Mansfield T. DNA-restriktionsfragment associerade med alfa 1-antitrypsin indikerar ett enda ursprung för bristallelen PI Z. Nature 1985;316:79-81.

9. Crystal RG, Brantly ML, Hubbard RC, Curiel DT, States DJ, Holmes MD. Alfa 1-antitrypsingenen och dess mutationer. Kliniska konsekvenser och behandlingsstrategier. Chest 1989;95:196-208.

11. Curiel D, Brantly M, Curiel E, Crystal RG. Alfa-1-antitrypsinbrist orsakad av alfa-1-antitrypsin Nullmattawa-genen. En insättningsmutation som gör alfa-1-antitrypsingenen oförmögen att producera alfa-1-antitrypsin. J Clin Invest 1989;83:1144-52.

12. Dermer SJ, Johnson EM. Snabb DNA-analys av alfa-1-antitrypsinbrist: tillämpning av en förbättrad metod för amplifiering av muterad gensekvens. Lab Invest 1988;59:403-8.

13. Deutsch J, Becker H, Auböck L. Histopatologiska drag av leversjukdom vid alfa 1-antitrypsinbrist. Acta Paediatr 1994;393 Suppl:8-12.

14. Dubel JR, Finwick R, Hejtmancik JF. Denaturerande gradientgelelektrofores av alfa 1-antitrypsingenen: tillämpning på prenatal diagnostik. Am J Med Genet 1991;41:39-43.

15. Evans HE, Levi M, Mandl I. Serumkoncentrationer av enzymhämmare vid andningssvårigheter. Am Rev Resp Dis 1970;101:359-63.

18. Ishak KG. Hepatisk morfologi vid ärftliga metaboliska sjukdomar. Sem Liver Dis 1986;6:246-58.

20. Lai EC, Kao FT, Law ML, Woo SL. Tilldelning av alfa 1-antitrypsingenen och en sekvensrelaterad gen till människans kromosom 14 genom molekylär hybridisering. Am J Hum Genet 1983;35:385-92.

21. Laurell CB, Eriksson S. The electrophoretic alpha-1-globulin pattern of serum in alpha-1-antitrypsin deficiency. Scand J Clin Lab Invest 1963;15:132-40.

22. Laurell CB, Kullander S, Thorell J. Effekten av administrering av ett kombinerat strogen-progestagen preventivmedel på nivån av enskilda plasmaproteiner. Scand J Clin Lab Invest 1968;21:337-43.

23. Massi G, Chiarelli C. Alfa 1-antitrypsin: molekylärt och Pi-systemet. Acta Paediatr 1994;393 Suppl:1-4.

26. Okayama H, Curiel DT, Brantly ML, Holmes MD, Crystal RG. Snabb icke-radioaktiv detektion av mutationer i det mänskliga genomet genom allelspecifik amplifiering. J Lab Clin Med 1989;114:105-13.

28. Perlmutter DH. Kliniska manifestationer av alfa 1-antitrypsinbrist. Gastroenterol Clin North Am 1995;24:27-43.

30. Serra HG. Identificação molecular dos alelos S e Z do gene da alfa-1-antitripsina em um grupo de pacientes portadores de doença pulmonar crônica . Campinas, SP: Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas; 1998.

31. Silverman EK, Miletich JP, Pierce JA, Sherman LA, Endicott SK, Broze GJ, Campbell EJ. Alpha-1-antitrypsinbrist. Hög prevalens i St Louis-området fastställd genom direkt screening av befolkningen. Am Rev Respir Dis 1989;140:961-6.

32. Sveger T. Liver disease in alpha 1-antitrypsin deficiency detected by screening of 200,000 infants. N Engl J Med 1976;294:1316-21.

33. Sveger T. Leversjukdomens naturliga utveckling hos barn med alfa 1-antitrypsinbrist. Acta Paediatr Scand 1988;77:847-51.

35. Talbot IC, Mowat AP. Leversjukdom hos spädbarn. Histologiska särdrag och samband med alfa 1-antitrypsinfenotyp. J Clin Pathol 1975;28:559-63.

36. Travis J, Salvesen GS. Proteinashämmare i mänsklig plasma. Annu Rev Biochem 1983;52:655-709.

37. Van Steenbergen W. Alfa 1-antitrypsinbrist: en översikt. Acta Clin Belg 1993;48(3):171-89.

38. Wewers MD, Casolaro MA, Sellers SE, Swayze SC, McPhaul KM, Wittes JT, Crystal RG. Bristande ersättningsterapi i samband med emfysem. N Engl J Med 1987;316:1055-62.

Recebido em 3/11/1999.
Aprovado em 6/11/2000.

* Studie utförd av avdelningarna för barnmedicin, medicinsk genetik, anatomisk patologi och klinisk patologi vid fakulteten för medicinska vetenskaper (FCM), State University of Campinas – UNICAMP, Campinas, SP, Brasilien.

1 Doktorand. Institutionen för barnmedicin, FCM/UNICAMP.

2 Biträdande professor. Institutionen för klinisk patologi, FCM/UNICAMP.

3 Biträdande professor. Institutionen för anatomisk patologi, FCM/UNICAMP.

4 Doktorsexamen i genetik (biologiska institutet), UNICAMP.

5 Biträdande professor. Institutionen för medicinsk genetik, FCM/UNICAMP.

6 Biträdande professor. Institutionen för barnmedicin, FCM/UNICAMP.