O teste oxidante-fermentativo (OF) foi desenvolvido por Hugh e Leifson em 1953. Eles desenvolveram o teste OF para diferenciar entre bactérias oxidativas (que produzem ácido de carboidratos somente em condições aeróbicas) e bactérias fermentativas (que produzem ácido tanto em condições aeróbicas quanto anaeróbicas).
Microorganismos sacarolíticos degradam a glicose tanto em condições fermentativas quanto em condições oxidativas. Os produtos finais da fermentação são ácidos mistos relativamente fortes que podem ser detectados em um meio de teste de fermentação convencional. Contudo, os ácidos formados na degradação oxidativa da glicose são extremamente fracos e menos ácidos, e o meio de fermentação oxidativo mais sensível do meio Hugh e Leifson’s OF é necessário para a detecção. O meio foi feito aumentando a quantidade de glicose acima da encontrada no meio utilizado para detectar a fermentação e diminuindo a quantidade de peptona.
O meio de fermentação de Hugh e Leifson difere dos carboidratos da seguinte forma:
- A concentração de ágar é diminuída de 3% para 2%, tornando-o semissólido em consistência (Isto auxilia na determinação da motilidade do organismo).
- A concentração de peptona é diminuída de 11% para 2%. (diminuindo a quantidade de produto alcalino produzido pelo metabolismo da peptona; reduzindo assim o efeito neutralizante destes produtos).
- A concentração de carboidratos é aumentada em 0,5% para 1.0% (O aumento da concentração de glicose no meio aumenta a produção destes ácidos fracos a um nível que pode ser detectado pelo indicador azul de bromotimol)
Princípio:
O teste oxidativo-fermentativo determina se certas hastes gram-negativas metabolizam glicose por fermentação ou respiração aeróbica (oxidativa). Durante o processo anaeróbico de fermentação, o piruvato é convertido em uma variedade de ácidos mistos, dependendo do tipo de fermentação. A alta concentração de ácido produzido durante a fermentação transformará o indicador azul de bromthymol em meio OF de verde para amarelo na presença ou ausência de oxigênio .
Determinadas bactérias gram-negativas não fermentadoras metabolizam a glicose usando respiração aeróbia e, portanto, produzem apenas uma pequena quantidade de ácidos fracos durante o ciclo de glicólise e Krebs. A diminuição da quantidade de peptona e o aumento da quantidade de glicose facilita a detecção dos ácidos fracos assim produzidos. O tampão fosfato dipotássico é adicionado para promover a detecção de ácidos.
Uses:
OF Teste é usado para determinar se as bactérias gram-negativas metabolizam os carboidratos oxidativamente, por fermentação, ou são não-sacrolíticos (não têm capacidade de usar os carboidratos no meio).
Media:
Hugh e Leifson’s OF basal medium; os constituintes são os seguintes:
- Cloreto de sódio : 5,0 g
- Fosfato de di-potássio : 0,3 g
- Peptona : 2.0 g
- Azul de bromotimol : 0,03 g
- Agar: 3,0 g
- Glicose : 10 g
- Água : 1000 ml
O pH deve ser ajustado para 7,1 antes da autoclavagem. Após o meio ser autoclavado a 121°C por 15 minutos, uma solução filtrante esterilizada a 10% de solução de carboidrato é adicionada assepticamente ao meio até uma concentração final de 1%.
Procedimento
- Inocular dois tubos de meio de teste OF com o organismo de teste usando um fio reto, esfaqueando “meio caminho até o fundo” do tubo.
- Cobrir um tubo de cada par com uma camada de 1 cm de óleo mineral estéril ou parafina líquida (cria condição anaeróbica no tubo, evitando a difusão de oxigênio), deixando o outro tubo aberto para o ar.
- Incubar ambos os tubos a 35°C durante 48 horas (bactérias de crescimento lento podem demorar 3 a 4 dias até que os resultados possam ser observados)
Interpretação
A produção de ácido é detectada no meio pelo aparecimento de uma cor amarela. No caso de organismos oxidativos; a produção de cor pode ser notada primeiro perto da superfície do meio.
Seguir são os padrões de reação:
- Resultado fermentativo: Produção de ácido em ambos os tubos (abertos e cobertos). O ácido produzido altera o indicador de pH, azul de bromotimol, de verde para amarelo. ex. Escherichia coli
- Resultado oxidativo: A produção de ácido no tubo aberto (aeróbico) e não no tubo coberto com óleo (anaeróbico) indica um resultado oxidativo. As bactérias não fermentantes que metabolizam a glucose através do metabolismo oxidativo dão um resultado oxidativo, por exemplo, Pseudomonas aeruginosa
- Não sacarolítico (resultado OF negativo): Bactérias não sacrolíticas dão um resultado OF negativo. O resultado negativo é indicado por nenhuma mudança de cor no tubo coberto com óleo e em alguns casos um aumento do pH (pH 7,6) mudando o azul de bromotimol de verde para azul na parte superior do tubo aberto. O aumento no pH é devido à produção de aminas por bactérias que quebram a peptona (proteína) no meio.
e.g. Alcaligenes faecalis.
Controle de qualidade
- Glucose Fermenter: Escherichia coli
- Oxidante de glicose: Pseudomonas aeruginosa
- Nonsacarolítico: Espécie Moraxella
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