Resultados e Discussão
Ativação constitucional do fator de transcrição NF-κB é considerada essencial para a transformação de células B pela proteína de fusão API2-MALT1 de linfomas MALT com uma translocação t(11;18) . A superexpressão transitória da API2-MALT1 em 293 células T resulta na ativação robusta de um gene reportador da luciferase NF-κB , fornecendo assim um sistema modelo útil para estudar os mecanismos pelos quais a API2-MALT1 sinaliza para a NF-κB. Para monitorar a eficiência da transfecção, co-expressámos o pEGFP-N2 (Clontech) em vários experimentos. Para nossa surpresa, observamos que o EGFP inibiu a ativação de NF-κB induzida pelo API2-MALT1 de forma dependente da dose (Fig. 1A). Em contraste, EGFP não afetou a ativação do reportador induzida pela expressão das subunidades p50/p65 de NF-κB (Fig 1B), sugerindo uma interferência com a cascata de sinalização de NF-κB ativada pela API2-MALT1 a montante de NF-κB.
- Slide PowerPoint
- imagem maior
- imagem original
(A) A ativação de um reportador de luciferase NF-κB por uma proteína de fusão API2-MALT1 marcada com bandeira é inibida por EGFP de uma forma dependente da dose.
(B) EGFP não bloqueia a atividade da luciferase dependente de NF-κB induzida pela expressão das subunidades p50/p65 de NF-κB (C) Ativação de um reportador de luciferase NF-κB por Flag-API2-MALT1 é inibido pelo EGFP mutado para o motivo de ligação TRAF6 (D) EGFP mas não pmaxGFP impede a ativação induzida por TNF-α da NF-κB luciferase reporter e fosforilação de IκB-α e JUN em 293T células.
EGFP não aumenta os níveis de HSP70 ou induz HSP70B′ em 293T células.
Fluorescência de intensidades (Ex485/Em520nm) para EGFP e pmaxGFP foram ambas ∼100 dobradas acima do fundo. (E) N- e/ou C-terminal de proteínas de fusão EGFP (para API2, CHIC2, NXF5a, NXF1, MALT1, Actin, Rab5, Syndecan binding protein 2 (SDCBP2) ou β-Tubulin) e EGFP com um sinal de localização nuclear (NLS) ou um site de farnysilation (pEGFP-F) reduzem a atividade do repórter de NF-κB luciferase induzida por TNF-α em 293T células. Fundo: Em humanos, a HSP70 é constitutivamente expressa sob condições normais, mas Hsp70B′ é induzida apenas em resposta ao stress.
Não há expressão basal de Hsp70B′.
Como um controle positivo para a expressão HSP70B′, 293T células (pista 2) sofreram choque térmico a 44°C por duas horas (pista 3) e foram permitidas a recuperar a 37°C por 5 (pista 4) ou 18 (pista 5) horas antes da colheita. Atividade luciferase dependente de NF-κB é representada para cada experimento como indução de células vetoriais transfectadas e é representada graficamente como a média e desvio padrão de pelo menos três experimentos independentes.
Todos os padrões de peso molecular estão em kDa.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g001
MALT1 é um componente de sinalização essencial da via de recepção de antígenos em direção a NF-κB , . Acredita-se que o BCL10 medeia a oligomerização do MALT1, o que permite a formação de um complexo com TRAF6. A oligomerização do TRAF6 elicita a atividade da ubiquitina ligase E3 de seu domínio RING, resultando na modificação do IKKγ (NEMO) através das cadeias de poliubiquitina ligadas ao Lys63. Isto facilita então a interação de IKKγ com TGFβ ativando a kinase 1 (TAK1), que ativa totalmente o complexo IκB kinase (IKK) via fosforilação de IKKβ , levando assim à ativação da NF-κB. Da mesma forma, a proteína de fusão API2-MALT1 ativa a NF-κB através da poliubiquitinação mediada por TRAF6 de IKKγ , . A interação do TRAF6 com a Carboxi-termina de MALT1 ocorre através de dois potenciais motivos de ligação do TRAF6 (PxExxAr/Ac com Ar/Ac para um resíduo aromático ou ácido . A inspecção da sequência EGFP revelou a presença de um consenso de ligação do TRAF6 (PNEKRD, AA 212-217). A estrutura cristalina do EGFP mostra que o motivo PNEKRD é exposto em um loop entre duas folhas beta, sugerindo sua acessibilidade e um papel para o EGFP como regulador negativo através do seqüestro do TRAF6. Entretanto, experimentos co-IP falharam em demonstrar uma interação entre EGFP e TRAF6 (dados não mostrados) e mutantes para o consenso vinculante TRAF6 bloquearam a ativação de NF-κB pelo API2-MALT1 tão eficiente quanto EGFP (Fig. 1C).
Para investigar se o efeito estava limitado ao API2-MALT1, analisamos TNF-α induziu a ativação de NF-κB em 293T células expressando EGFP. Novamente, a EGFP reduziu a sinalização de NF-κB como demonstrado pela menor atividade do repórter e reduziu a fosforilação do inibidor de NF-κB, IκB-α (Fig. 1D). A seguir, avaliamos se as proteínas de fusão EGFP poderiam ter o mesmo efeito. As fusões de N- e C-terminal EGFP bloquearam API2-MALT1- (dados não mostrados) e a ativação de NF-κB induzida por TNFα (Fig 1E). Além de ativar a via NF-κB, o tratamento com TNF-α também aciona a sinalização JNK. A fosforilação de JUN, indicativa da sinalização de JNK ativada, é reduzida pela EGFP também após o tratamento com TNF-α (Fig 1D).
Foi relatado que a visualização prolongada da GFP expressando células induz a produção de espécies reativas de oxigênio, o que pode resultar em mudanças fisiológicas e eventualmente na morte celular . Curiosamente, ambos os mutantes EGFP para o consenso de ligação TRAF6 tinham perdido sua fluorescência verde, mas inibiram eficientemente a sinalização de NF-κB (Fig. 1C). Além disso, a pmaxGFP (Amaxa Biosystems), uma proteína fluorescente estruturalmente diferente, não afetou a ativação da NF-κB e JNK no tratamento da TNF-α (Fig. 1D), sugerindo que a inibição não resultou da fototoxicidade associada aos radicais livres. Outro estudo indicou que níveis elevados de EGFP podem induzir a proteína de choque térmico 70 (HSP70) , que é capaz de inibir a ativação da NF-κB através de sua interação com IKKγ e TRAF6 . Entretanto, a indução da HSP70 foi restrita às células endoteliais e não observamos aumento dos níveis de HSP70 ou indução de HSP70B′ em EGFP expressando 293T células (Fig 1D-E).
Ativação da NF-κB pela expressão API2-MALT1 ou pelo tratamento com TNF-α está associada à modificação do IKKγ com poliviciclitina Lys63-linked pelo TRAF6 ou TRAF2 respectivamente , . Além disso, a sinalização JNK induzida por TNFα requer a auto-ubiquitinação TRAF2 . Para avaliar um possível efeito do EGFP na actividade da ligase ubiquitina do anel E3 do TRAF6 ou TRAF2, monitorizamos a ubiquitinação através de um agente de ubiquitina marcado com HA com apenas o Lys63 disponível para polimerização (HA-Ub-K63). A expressão da estimulação API2-MALT1 ou TNF-α aumentou o nível de proteínas poli-ubiquitinadas em 293 células de T e foi associada à poli-ubiquitinação melhorada em imunoprecipitados IKKγ, e ambos os processos foram bloqueados por EGFP (Fig. 2A, faixas 1,2,5,6). Além disso, o EGFP reduziu o nível basal da polibiquitinação ligada ao K63 em 293T células (Fig. 2A, faixas 3 e 4). Da mesma forma, a expressão do tratamento API2-MALT1 ou TNFα estimula a montagem da cadeia de ubiquitina K48-linked, que é novamente bloqueada pelo EGFP e seu homólogo estrutural dsRed (Clontech) mas não pelo pmaxGFP (Fig 2B).
- Slide PowerPoint
- imagem maior
- imagem original
(A) 293T células transfectadas com as construções indicadas e tratadas durante 4 horas com 20 ng/ml de TNF-α (pista 5 e 6) foram imunoblotadas com anti-Flag (API2-MALT1), anti-HA (HA-Ub-K63) e anticorpos anti-EGFP (painel esquerdo) ou imunoprecipitados anti-IKKγ foram imunoblotados com anti-Flag (IKKγ) ou anti-HA (ubiquitina) (painel direito).
(B) EGFP afeta a polubiquitinação K48-linked.
293T células foram transfectadas com uma construção de Ubiquitina com apenas Lys48 disponível para polimerização (HA-Ub-K48), tratadas por 4 horas com 20 ng/ml de TNF-α ou não tratadas e os lisados celulares foram immunoblotted com anticorpos anti-HA (Ub-K48) e anti-EGFP.
As intensidades de fluorescência (Excitação 485/Emissão 520 nm) para EGFP e pmaxGFP foram comparáveis (∼100 dobrar valores superiores aos de fundo), a expressão de pDs-Red foi confirmada por microscopia de fluorescência.
(C) EGFP estabiliza o exógeno API2-Myc em 293T células via redução de sua auto-ubiquinação Lys48-linked e degradação proteasomal.
(D) Expressão estável do EGFP na linha de células do carcinoma merkel MCC14.2 reduz a polibiquitinação e aumenta os níveis de expressão endógena do p53.
A razão média e o desvio padrão do p53 para os sinais de actina são dados (três experiências independentes), (Ub)n : proteínas polibiquitinadas.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g002
Para investigar se o EGFP afeta exclusivamente a ubiquitinação pelas proteínas TRAF, avaliamos API2, uma ligase ubiquitina RING E3 que se desestabiliza através da auto-ubiquitinação Lys48-linked . A co-expressão da EGFP inibiu a poli-ubiquitinação induzida por API2 em 293T células resultando em um aumento dos níveis de expressão de API2 (Fig. 2C). Níveis reduzidos de ubiquitinação em estado estável também foram observados em células MCC14,2 com expressão estável de EGFP. Como conseqüência, os níveis basais de p53 endógenos, que são regulados de forma rigorosa através da ubiquitinação Lys48-linked pelo MDM2, estão ligeiramente aumentados nas células que expressam EGFP (Fig 2D).
Próximo examinamos se o EGFP afeta a ubiquitinação in vivo. Os níveis basais de polibiquitinação foram reduzidos nos linfócitos esplênicos de camundongos transgênicos EGFP, o que foi associado com a redução da fosforilação de IκB-α após a estimulação antigênica em comparação aos camundongos controle, indicando que o EGFP reduz a ativação de NF-κB induzida pelo receptor de células B (Fig. 3A-B). Os ratos transgénicos API2-MALT1 têm um défice de células B B220+/CD40+ na sua medula óssea, uma vez que a activação de NF-κB mediada por API2-MALT1 acelera a sua maturação para células B ingénuas. Quando esses ratos transgênicos API2-MALT1 foram cruzados com ratos EGFP, o déficit de células B B220+/CD40+ na medula óssea dos ratos EGFP/API2-MALT1 transgênicos duplos (Fig. 3C) foi restaurado, suportando ainda mais um impacto na ubiquitinação e sinalização de NF-κB in vivo. Da mesma forma, a polibiquitinação foi reduzida nas células hepáticas de camundongos EGFP e foi associada à estabilização p53, como demonstrado pelo aumento do seu nível de expressão (Fig. 3A, D). O principal gene alvo da p53 em γ-irradiação-induzida dano de DNA no fígado é p21, que é necessário para a parada do ciclo celular e reparação do DNA . Assim, γ-irradiação induzida dano de DNA causou não só uma resposta maior de p53 em camundongos EGFP, mas também a indução de p21 foi ligeiramente aumentada (Fig. 3D). Finalmente, experiências in vitro foram realizadas para avaliar se o EGFP afeta diretamente a montagem da cadeia de ubiquitina; contudo, o EGFP recombinante não afetou a polibiquitinação de um substrato de controle (Fig. 3E), sugerindo um efeito dependente do contexto celular do EGFP na ubiquitinação.
- Slide PowerPoint
- imagem maior
- imagem original
(A) Florescências ocidentais de baço e extratos de fígado do tipo selvagem FVB (wt) e ratos transgênicos EGFP detectados com anticorpos contra Ubiquitina, EGFP e actina (controle de carga).
(B) EGFP reduz a fosforilação de IκB-α em antiIgM/anti-CD40 estimulados B-lymphocytes purificados de ratos EGFP.
Experimentos realizados em triplicado, é mostrada uma imagem representativa de um experimento.
São dados os desvios médios e padrões das proporções de IκB-α-P para a actina em relação às células não estimuladas.
(C) O déficit de células B220+/CD40+ B na medula óssea de ratos API2-MALT1 é restaurado em ratos EGFP/API2-MALT1 com duplo transgênico.
Experimentos realizados em triplicata, os desvios médio e padrão são representados. eMalt1: malte endógeno1, *uma banda específica (D) ratos EGFP mostram níveis aumentados de p53 no fígado e têm respostas p53/p21 melhoradas em γ-irradiação induzida por danos no DNA.
São dados os desvios médios e padrões das proporções de p53/p21 para sinais de actina em relação à amostra 1.
(E) O EGFP recombinante (rEGFP) não previne a polibiquitinação de um substrato de Biotina-Lisozima in vitro. (Ub)n: proteínas poli-ubiquitinadas.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g003
Em conclusão, nossos dados indicam que as proteínas de fusão EGFP e EGFP afetam os processos RING E3 ubiquitina liga-dependente como NF-κB e sinalização JNK ou homeostase p53 em linhas celulares e em camundongos. A NF-κB desempenha um papel central na regulação de diversos processos biológicos, incluindo imunidade inata e adaptativa, desenvolvimento, crescimento celular e sobrevivência. Os sinais pró-sobrevivência resultam da expressão elevada de inibidores de apoptose, como a leucemia de células B/lymphoma-XL. Portanto, o aumento da apoptose induzida pela EGFP nas células ou no córtex motor e estriato do cérebro de ratos pode estar relacionado à redução da atividade da NF-κB devido à polibiquitinação defeituosa e ativação/degradação de seus reguladores a montante. A ubiquitinação defeituosa também é postulada para causar distrofia muscular da cintura do membro, que está associada a mutações em Trim32, uma ligase de ubiquitina para a actina . Como foi demonstrado que o EGFP prejudica as interações actina-miosina nas células musculares e induz a cardiomiopatia dilatada em ratos EGFP , é tentador especular que a ubiquitinação da actina pode desempenhar um papel essencial no funcionamento muscular normal e que sua desregulação pelo EGFP causa os fenótipos acima mencionados. Portanto, em vista do papel emergente da ubiquitinação em numerosos processos celulares, o uso do EGFP como um repórter celular vivo deve ser cuidadosamente considerado.
Deixe uma resposta