Nucléolo

O nucléolo está contido dentro do núcleo da célula.

O nucléolo (nucléolos plurais) é um grande e distinto subcompartimento esferoidal do núcleo das células eucariotas que é o local de síntese do RNA ribossómico (rRNA) e montagem das subunidades ribossómicas. Um nucleoli é às vezes referido como uma “organela não membranosa” ou “organela sem membrana nuclear” no sentido mais amplo do termo organela; no entanto, nucleoli carece de uma membrana e, portanto, não são organelas no sentido mais técnico das estruturas que estão encerradas separadamente dentro de sua própria membrana lipídica. A maioria das células vegetais e animais tem um ou mais núcleos, mas alguns tipos celulares não têm nenhum.

O nucléolo é uma estrutura altamente dinâmica da qual os componentes são dispersos no início da mitose e são remontados no final da divisão celular. Este corpo intrincado trabalha em cooperação com outros componentes nucleares para fornecer uma função valiosa para a célula. Entretanto, quando esta complexa coordenação em células humanas é interrompida, como por infecção viral, mutações congênitas ou aumento de atividade, várias doenças humanas podem resultar.

Overvisão

Esquema de célula animal típica, mostrando componentes subcelulares. Organelas:
(1) nucleolus
(2) nucleus
(3) ribossomos (pequenos pontos)
(4) vesícula
(5) retículo endoplasmático grosso (ER)
(6) aparelho de Golgi
(7) Cytoskeleton
(8) retículo endoplasmático liso (ER)
(9) mitocondria
(10) vacuole
(11) cytoplasm
(12) lysosome
(13) centrioles within centrosome

O nucléolo é uma estrutura nuclear grande e distinta que é altamente organizada e carece de uma membrana. A principal função do nucléolo é a biogénese e montagem dos componentes do ribossoma (rRNA, proteínas do ribossoma). Este sítio de transcrição do DNA ribossómico (rDNA) tem sido referido como uma “máquina produtora de ribossomas” (Alberts et al. 1989). O nucleolus pode ser visualizado através de microscopia electrónica enquanto que a organização e dinâmica podem ser estudadas através de Marcação de Proteínas Fluorescentes e Recuperação Fluorescente após Photobleaching (FRAP).

Numa célula não mitótica, observada sob um microscópio de luz, o nucleolus é a estrutura mais óbvia do núcleo (Alberts et al. 1989). Entretanto, durante os estágios iniciais da divisão celular, os nucléolos são fragmentados (não podem mais ser vistos em metáfase). Na transição entre a telophase e a interfase. eles se remontam em torno das regiões de cromatina onde a transcrição do rDNA é reiniciada. As seqüências de rDNA codificam as moléculas de rRNA (RNA ribossômico) dos ribossomos.

Em vez de ser ligado por uma membrana, o nucleolus parece ser construído a partir da ligação específica de precursores de ribossomos inacabados, formando uma grande rede (Alberts et al. 2004). Três regiões de um nucléolo podem ser distinguidas: um centro fibrilar (que contém DNA que não está sendo transcrito ativamente), um componente fibrilar denso (contém moléculas de RNA sendo transcritas), e um componente granular (contém partículas precursoras ribossômicas maduras) (Alberts et al. 1989). Esta região posterior ajuda a distinguir a fronteira com o nucleoplasma circundante, apesar da falta de uma membrana.

Desde que os nucléolos realizam a produção e maturação dos ribossomas, um grande número de ribossomas é encontrado dentro deles. Para além da biogénese dos ribossomas, acredita-se que os nucléolos têm outros papéis na actividade celular. Além disso, de acordo com pesquisas recentes, os nucléolos são também responsáveis pelo tráfico de várias espécies proeminentes de RNA de pequeno porte. O nucleolus ajuda-os durante o seu processo de maturação e encaminhamento para o seu destino celular final. Além disso, embora os nucléolos se tornem invisíveis durante a divisão celular, estudos recentes descobriram que eles estão envolvidos na regulação do ciclo celular. Vários de seus papéis não tradicionais incluem interação com componentes virais, a regulação das atividades de supressão tumoral e oncogene, a montagem de partículas de reconhecimento de sinal, a modificação de pequenos filamentos de RNA, o controle do envelhecimento, e a função telomerase modulante.

Citologistas precoces estavam tão interessados nos nucléolos facilmente visíveis que uma revisão de 1898 listou cerca de 700 referências (Alberts et al. 1989). Citologistas demonstraram na década de 1940 que os nucléolos contêm altas concentrações de RNA e proteínas (Alberts et al. 1989). Em 1964, John Gurdon e Donald Brown descobriram nucléolos celulares no sapo africano Xenopus laevis. Eles descobriram que 25% dos ovos de rã não tinham nucléolos e que tais ovos não eram capazes de viver. Metade dos ovos tinha um nucléolo e 25 por cento tinha dois. Eles concluíram que o nucléolo tinha uma função necessária para a vida. Em 1966 Max L. Birnstiel e Hugh Wallace mostraram através de experiências de hibridação que os nucléolos codificam o DNA ribossomal.

Morfologia do nucléolo

Núcleos são tipicamente compostos de três regiões morfologicamente distintas, que podem ser visualizadas por microscopia eletrônica (EM) (Hernandez-Verdun 2006a; 2006b; Olson e Dundr 2005; Raška et al. 2006; Thiry e Lafontaine 2005):

1. Fibrillar Center (FC):

• lightly stained when observed by EM
• composto de “fibrilhas” (± 50Ǻ em Ø)
• presença de pol I e UBF
• multiple FC em um nucléolo
• conta apenas 1-2 por cento do volume total do nucléolo

2. Dense Fibrillar Center ou Dense Fibrillar Component (DFC):

• componente de “fibras densamente embaladas” (30-50 Ǻ em Ø)
• ocupa uma grande fração do nucléolo, ± 17% e reflete aproximadamente o acoplamento nucleolar na biogênese do ribossomo

3. Região granular ou Componente Granular (GR):

• região abrangendo tanto a CF como o DFC
• composto de grânulos 150-200 Ǻ em Ø
• região rica em grânulos devido à presença de partículas de RNP
• com uma fração de cerca de 75 por cento, ocupa a maior fração do volume total de nucleolus
• embora o nucleolus não esteja ligado à membrana, devido à presença de GC, a borda com a cromatina e nucleoplasma circundantes é geralmente distinta.

Um componente substancial (adicional) do nucleoplasma é a cromatina, que penetra na organela a partir do nucleoplasma circundante.

Existe uma ligação contínua entre o nucleoplasma e as partes internas do nucleoplasma através de uma rede de canais nucleolares. Desta forma, macromoléculas com peso molecular até 2000 kDa são facilmente distribuídas pelo nucleoplasma.

Uma última estrutura é identificada dentro do nucleoplasma e é referida como um vacúolo nucleolar. Existem múltiplos vacúolos nucleolares no nucléolo, mas ainda não está claro se eles servem ou não a algum propósito funcional ou estrutural.

Embora a “organização tripartite” (CF, DFC, GC) do nucléolo seja comumente aceita, foi proposto que esta organização em particular só é observada em eucariotas superiores e que ela evoluiu de uma organização bipartite com a transição de anamniotas para amniotas. Refletindo o aumento substancial na região intergênica do rDNA, um componente fibrilar original teria se separado na CF e no DFC (Thiry e Lafontaine 2005).

A transcrição do nucléolo e do rDNA/ processamento do rRNA/montagem doribossomo

Montagem do nucléolo ocorre de forma não aleatória. Os núcleóis são formados em torno de loci genéticos específicos chamados regiões organizadoras nucleolares (NOR’s). Anteriormente descrito por McClintock como o “elemento organizador nucleolar”, um NOR é composto de repetições tandem de genes rRNA que estão presentes em múltiplas cópias ao longo do genoma. O genoma humano, por exemplo, contém mais de 200 cópias do gene rRNA e elas estão agrupadas em cinco cromossomos diferentes. Em uma eucariote típica, um gene rRNA consiste de um promotor, espaçadores transcritos internos e externos (ITS/ETS), seqüências de codificação do rRNA (18S, 5.8S, 28S), e um espaçador transcrito externo “não” (Alberts et al. 2002).

Na biogênese do ribossomo, três polimerases eucarióticas do RNA (pol I, II, III) são necessárias, que funcionam de forma coordenada. Numa fase inicial, os genes do rRNA são transcritos como uma única unidade dentro do nucleolus pelo RNA pol I. Para que esta transcrição ocorra, são necessários vários factores associados ao pol I e factores de transacção específicos do rDNA. Em leveduras, os mais importantes são UAF (upstream activating factor), TBP (tata-box binding protein), e CF (core factor), que ligam elementos promotores e formam o complexo de pré-iniciação (PIC), que por sua vez é reconhecido pelo pol I.

Em humanos, um PIC similar é montado com SLI, o fator de seletividade promotor, que é composto de TBP e fatores associados ao TBP (TAF), IF, o fator de iniciação de transcrição, e UBF, fator de ligação a montante.

Transcrição do gene ribossômico produz uma molécula precursora longa (45S pré-RNA), que ainda contém o sapador transcrito interno (ITS) e o espaçamento transcrito externo (ETS). O processamento adicional, que envolve metilação e atividade endo/exonuclease, é portanto necessário para gerar as moléculas 18S rRNA, 5.8S, e 28S rRNA. As enzimas modificadoras de RNA são trazidas para seus respectivos locais de reconhecimento através da interação com RNA’s guias, que ligam essas sequências específicas. Os RNA’s guia pertencem à classe de RNA nucleolar pequeno (snoRNA’s), que são complexados com proteínas e existem como pequeno-nucleolar-ribonucleoproteína (RNP) partículas (snoRNP’s).

Once rRNA é processado, as moléculas de rRNA estão prontas para ser montadas em ribossomos. Entretanto, uma molécula adicional de RNA, o rRNA 5S, é necessária para esta biogênese. Na levedura, a seqüência 5S rDNA é localizada no espaçador externo “não” transcrito e é transcrito no nucléolo pelo RNA pol III. Em eucariotas e plantas superiores, a situação é mais complexa, pois a sequência de rDNA 5S encontra-se fora do NOR e é transcrita no nucleolus, após o que é importada no nucleoplasma para participar na montagem do ribossomo. Esta montagem não envolve apenas o rRNA, mas também as proteínas do ribossomo. Os genes que codificam estas r-proteínas são transcritos pelo pol II no nucleoplasma por uma via “convencional” de síntese proteica (transcrição, processamento pré-RNAM, exportação nuclear de mRNA maduro e tradução em ribossomos citoplasmáticos). As r-proteínas maduras são então reimportadas para o nucleolus. A associação e maturação do rRNA e r-proteínas resultam na formação das subunidades 40S e 60S do ribossomo. Estas são exportadas através dos complexos de poros nucleares para o citoplasma onde permanecem livres ou serão associadas ao retículo endoplasmático (Alberts et al. 2002; Cooper e Hausman 2007).

Organização e dinâmica nucleolar

Proteínas nucleolares múltiplas e pequenos RNA nucleolares (snoRNA’s) associam-se para formar as máquinas de processamento necessárias na biogênese do ribossomo. Estão envolvidos na modificação das transcrições do rNA nascente através da metilação (2′-O-metilação/pseudouridilação) e clivagem endonucleolítica dos RNA pré-RNAs. Estes estágios de processamento estão confinados principalmente no DFC (componente fibrilar denso) como revelado pela presença destes snoRNP (pequenas partículas de ribonucleoproteínas-nucleares) que constituem proteínas, por exemplo, fibrilarina, nucleolina e snoRNA U3. Proteínas B23 e NOP52, envolvidas em estágios posteriores do processamento. estão localizadas no GC (componente granular).

Isto mostra que a organização dos núcleos é altamente regulada e dependente dos estágios do processamento do rRNA. Estas observações também levaram à hipótese de que a transcrição do rDNA deve ocorrer na CF (centro fibrilar) ou na junção entre a CF e o DFC, devido ao movimento vetorial para fora das transcrições pré-RNA enquanto são processadas para produzir rRNAs maduros.

Se considerarmos o conjunto completo de proteínas e RNAs necessários na biogênese do ribossomo, podemos supor que um nucleolus é simplesmente formado porque certas proteínas, envolvidas na transcrição dos genes rDNA, ligam-se às suas regiões alvo, e que ao seu redor há uma montagem espontânea de todos os elementos envolvidos na modificação dos rRNA nascentes. Portanto, a organização ocorre como consequência da biogénese do ribossoma.

Têm sido utilizadas abordagens experimentais transversais para obter uma visão detalhada sobre este processo de montagem em particular. As mais importantes são a Marcação de Proteína Fluorescente, na qual uma proteína de interesse é fundida com uma proteína fluorescente como a “proteína fluorescente verde” (GFP) e a Recuperação Fluorescente Após Fotodepilação (FRAP) que consiste em marcar uma proteína com uma proteína de fusão após a qual as moléculas fluorescentes na área de estudo são branqueadas com um laser. A intensidade fluorescente da área em estudo irá recuperar devido à difusão externa das moléculas branqueadas e difusão interna das moléculas não branqueadas. A primeira abordagem permite acompanhar o movimento do complexo fluorescente (3D+tempo) e a segunda permite medir o tempo de residência (tempo gasto em determinada área) da proteína fluorescente (em outras palavras, medir a mobilidade intracelular).

Bambos métodos experimentais se baseiam na capacidade de marcação de toda uma gama de proteínas associadas ao nucleolus, tais como proteínas nucleolares, histonas, proteínas de ligação ao DNA, fatores de transcrição e emendas. O rastreamento e medição do tempo de residência das proteínas marcadas permitiu demonstrar as rápidas taxas de associação/dissociação das proteínas nucleolares com outros componentes nucleolares, a troca contínua de proteínas entre o nucleolus e o nucleleoplasma durante a interfase e o envolvimento destas proteínas nucleolares com outros domínios nucleares. Verificou-se, por exemplo, que os corpos de Cajal (CB) são enriquecidos em pequenas ribonucleoproteínas nucleares e nucleolares e que estas contêm várias proteínas de processamento associadas à nucleolaridade, como a fibrilarina. Portanto, foi proposto que deveria existir uma relação funcional entre os núcleos e os corpos de Cajal (Hernandez-Verdun 2006a, 2006b).

Observações experimentais gerais indicam que o recrutamento dos nucleóleos constituintes ocorre de forma não aleatória e que é regulado pela progressão do ciclo celular. Durante a mitose, a máquina de transcrição permanece intimamente associada ao rDNA. No entanto, a transcrição é reprimida pelo complexo proteína quinase da ciclina B/Cdk1 (PMF). Este complexo é ativado no início da mitose e reprime as atividades nucleares através da fosforilação de uma série de proteínas kinases ou proteínas estruturais envolvidas nos rearranjos celulares necessários para a divisão celular adequada. É no final da mitose, quando o PMF é degradado através da clivagem proteolítica da ciclina B, que os núcleos se remontam em torno dos locais de rDNA em resposta ao reinício da transcrição do rDNA. As proteínas nucleolares são, ao contrário das proteínas envolvidas na transcrição, localizadas na periferia dos cromossomos durante a fase M do ciclo celular. Isto pode ser visualizado através da Marcação de Proteínas Fluorescentes. Na transição da telophase para G1, a maioria deles são agrupados em Corpos Prenucleares (PNB). São esses PNB que realizam a translocação dos cromossomos para os locais onde a transcrição do rDNA foi iniciada. Os PNB’s são pensados para funcionar como uma plataforma de montagem e como um reservatório para complexos proteicos, que liberam as proteínas de processamento nos locais de transcrição do rDNA. As proteínas de processamento precoce, como a fibrilarina, são recrutadas em resposta a uma diminuição da atividade da ciclina B/Cdk1, enquanto as proteínas de processamento tardio, como a B23 e Nop52, são recrutadas em resposta a uma atividade da quinase dependente da ciclina (cdk). Desta forma, as várias proteínas de processamento podem ser liberadas exatamente no momento em que são necessárias durante a síntese do rRNA (Hernandez-Verdun 2006a, 2006b).

Doenças humanas associadas ao nucleolus

Doenças humanas associadas a um mau funcionamento do nucleolus podem ser causadas por infecções virais, aumento da actividade nucleolar, ou simplesmente por mutações congénitas que afectam as proteínas nucleolares.

Se um vírus contém um sinal de alvo nucleolar (NOS) no seu genoma, alguma partícula viral será direccionada para o nucleolus. É o caso do vírus da imunodeficiência humana (HIV), que direciona a proteína HIV-1 Rev para o nucleolus. Através da interação com a proteína nucleolar B23, ela serve ao seu propósito regulando o padrão de emenda do mRNA do HIV-1, pois promove a exportação do mRNA não emendado para o citoplasma. Foi proposto que a proteína Rev seja localizada no nucleolus para proporcionar uma via alternativa de translocação do mRNA viral (não emendado/parcialmente emendado) do nucleoplasma para o citoplasma. Desta forma, o mRNA viral é protegido contra a degradação (que normalmente ocorreria para proteger a célula contra a tradução do mRNA pré (não processado).

Um aumento da atividade nucleolar terá um efeito sobre a superprodução de ribossomos, que eventualmente levará à tumorgenese e ao câncer. Um factor chave nestes núcleos disfuncionais é a proteína c-myc, produto do c-myc-proto-oncogene. Ela estimula a biogénese dos ribossomas através da regulação directa do pol I, influenciando a transcrição dos pol II, III e associando com o componente SL1 do complexo de pré-iniciação, o que aumenta a eficiência do recrutamento do pol I para o complexo de pré-iniciação.

Além disso, foram descritas várias mutações congénitas que afectam as proteínas nucleolares: Síndrome de Weine, síndrome de Treacher Collins, e síndrome de disqueratose congênita (Hernandez-Verdun 2006a, 2006b; Raška et al. 2006).

Priminação nucleolar

Priminação nucleolar também foi demonstrada para os genes rRNA. Em alguns organismos, particularmente plantas, quando dois núcleos são combinados em uma única célula durante a hibridação, o organismo em desenvolvimento pode “escolher” um conjunto de genes de rRNA para transcrição. Os genes rRNA do outro progenitor são suprimidos e geralmente não transcritos, embora a reactivação dos genes rRNA suprimidos ou “inferiores” possa ocasionalmente ocorrer. Esta preferência seletiva de transcrição dos genes rRNA é chamada de dominância nucleolar.

• Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, e J. D. Watson. Biologia Molecular da Célula, 2ª edição. Nova Iorque: Garland Publishing, 1989. ISBN 0824036956.

• Alberts, B., A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, e P. Walter. 2002. Molecular Biology of the Cell, 4ª edição. Nova Iorque: Garland Science. ISBN 0815332181.

• Cooper, G. M., e R. E. Hausman. 2007. A Célula: Uma Abordagem Molecular. Washington, DC: ASM Press. ISBN 9780878932191.

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• Khadzhiolov, A. A. 1985. O Nucleolo e a Biogênese do Ribossomo. Viena: Springer-Verlag. ISBN 3211817905.

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• Thiry, M., e G. Goessens. 1996. O Nucleolo Durante o Ciclo Celular. New York: Springer; Austin, TX: R. G. Landes. ISBN 3540613528.

Todos os links recuperados 14 de dezembro de 2018.

• Nucleolus sob microscópio eletrônico II.

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