Resultados

Para encontrar o comprimento de onda máximo de emissão para monitorar a intensidade de fluorescência do AMC após a clivagem de trypsin, os espectros de excitação e emissão foram medidos e são mostrados na Figura 1. O comprimento de onda máximo de emissão é de 440 nm.

Espectros de emissão (azul) e fluorescência (vermelho) de 50 µmol/L de AMC
Figure 1. Emissões (azul) e espectros de fluorescência (vermelho) de 50 µmol/L de AMC.

Para padronizar a intensidade de fluorescência medida da solução enzimática à concentração de AMC isolada, foi realizada uma titulação e a fluorescência medida. 0,5 mL de alíquotas de uma solução AMC de 50 µmol/L foi adicionado a uma solução enzimática de 2,5 mL e as concentrações iniciais e finais de AMC isolado estão resumidas na Tabela 1.

Tabela 1. Concentrações isoladas de AMC antes e depois da padronização da intensidade de fluorescência.

Concentração inicial 3 6 15 30 60 120 240
Concentração final 0.5 1 2,5 5 10 20 40

A cinética da actividade da tripsina foi então obtida através da medição da intensidade de fluorescência do AMC isolado aquando da clivagem da tripsina do substrato. A Figura 2 mostra a medida do curso temporal após 0,5 mL de concentrações variáveis da solução de substrato de Boc-Gln-Ala-Arg-MCA foram adicionados a 2,5 mL da solução enzimática.

Intensidade de fluorescência de concentrações variáveis do substrato adicionado à solução enzimática. As concentrações do substrato são as concentrações finais vistas na Tabela 1.
Figure 2. Intensidade de fluorescência de concentrações variáveis do substrato adicionado à solução enzimática. As concentrações do substrato são as concentrações finais vistas na Tabela 1.

Utilizando o programa de Análise Cinética, um gráfico Lineweaver-Burk (Figura 3) foi traçado a partir das medidas de curso temporal da fluorescência na Figura 2. O gráfico Lineweaver-Burk fornece parâmetros cinéticos enzimáticos tais como a taxa máxima da reação, Vmax, e a constante de Michaelis-Menten, Km. Vmax descreve a taxa da reação quando a enzima está saturada com substrato, enquanto Km indica a quantidade de substrato para atingir a velocidade máxima da reação. Vmax foi de 35.270 nmol/L-min-1 e Km foi de 5,99. A equação da linha foi 1/v = 0,000270 – 1/ + 0,0000284.

Lineweaver-Burk plot
Figure 3. Lote de Lineweaver-Burk.