No sistema HC-FIA, os FNPs com DNA funcionalizado amplificam o sinal da hibridação do RNA viral e do DNA na sonda. O princípio de desenho do biosensor HC-FIA é mostrado na Fig. 1.
a, O princípio do HC-FIA. b, Resultados representativos em uma faixa de fluxo lateral. c, O dispositivo de análise de fluorescência. d, Uma fotografia do laboratório portátil de malas, que tem um comprimento de 55,5 cm, uma largura de 37 cm e uma altura de 23 cm, com um peso de 8,5 kg. e, O processo de teste do ensaio de HC-FIA. Passo 1: hibridação do ácido nucleico numa incubadora a temperatura constante. Passo 2: determinação da intensidade dos sinais fluorescentes na placa de teste utilizando o dispositivo mostrado em c. f, Distribuição da sonda no genoma do SRA-CoV-2.
Desenho e funcionamento do ensaio HC-FIA
O murino S9.6 anticorpos monoclonais são prefixados na linha de teste (T) da faixa de fluxo lateral, e a linha de controle (C) é revestida com anticorpos policlonais IgG de cabra anti-coelho (Fig. 1a). Os FNP rotulados com anticorpos S9.6 e IgG de coelho são colocados dentro do tubo de reacção. No início do processo de detecção, a amostra do SRA-CoV-2 na garganta é lisada e libertada, e o RNA libertado hibrida com a sonda específica de ADN SRA-CoV-2. O RNA-DNA híbrido resultante é capturado pelos anticorpos S9.6 marcados com FNP, e o complexo flui ao longo do bloco de amostras e da membrana de nitrocelulose em direcção ao papel absorvente sob forças capilares. Ao passar através da área T, o complexo é capturado pelos anticorpos S9.6, gerando gradualmente um sinal fluorescente. Na área C, a IgG de coelho rotulada com FNP é capturada pela IgG anti-coelho. A presença ou ausência do RNA alvo da SRA-CoV-2 é baseada num valor de corte para intensidade de fluorescência (Fig. 1b,c). A Figura 1d mostra um laboratório portátil que tem a capacidade de fornecer resultados qualitativos em menos de uma hora após os dois passos seguintes: hibridação e análise de imunofluorescência (Fig. 1e).
Aqui utilizamos a razão entre o sinal de fluorescência do teste e o sinal de fluorescência de controlo (T/C) na tira de fluxo lateral de tal forma que a influência de qualquer fluorescência de fundo da placa de teste foi minimizada. Medindo a relação T/C das amostras de esfregaço de garganta de 211 indivíduos saudáveis, descobrimos que a relação T/C média de fundo foi de 49,95, com um s.d. de 17,16 (Fig. Suplementar 1a). A curva da característica operacional do receptor (ROC) e a área sob a curva (AUC) foram usadas para determinar o valor de corte e avaliar a precisão diagnóstica do ensaio de HC-FIA com base na sensibilidade e especificidade em vários limiares. Determinámos uma curva ROC com uma AUC de 0,999 com um intervalo de confiança (IC) de 95% de 0,997-1,000 (Figura Complementar 1b) utilizando amostras de esfregaço de garganta de 100 casos clinicamente confirmados e excluídos da COVID-19. O valor de corte que obteve a maior sensibilidade e especificidade foi determinado em 102,07, correspondendo ao ponto índice de Youden de 0,980. Alternativamente, um valor limiar de duas vezes o valor de fundo negativo (aqui, 49,95 × 2 = 99,90) é normalmente utilizado como valor de corte nos imunoensaios. Por conveniência, escolhemos um valor de corte T/C de 100,00.
Desenvolvimento do ensaio HC-FIA
Optimização das sondas de DNA para a sequência alvo do RNA do SRA-CoV-2 é a chave para melhorar a eficiência do ensaio. Uma lista de todas as sequências de sondas de ADN que desenhámos é fornecida na Tabela Complementar 1. O genoma do SRA-CoV-2 compreende aproximadamente 30,000 bases, incluindo um número variável (6-11) de quadros de leitura abertos (ORFs). A primeira ORF representa cerca de 67% de todo o genoma, e codifica 16 proteínas não-estruturais, bem como proteínas auxiliares e proteínas estruturais. As quatro principais proteínas estruturais são a glicoproteína spike (S), a proteína de envelope pequeno (E), a proteína matriz (M) e a proteína nucleocápside (N)15,16. A maioria dos ensaios de detecção de ácidos nucleicos para o SRA-CoV-2 utilizam as três regiões conservadas do genoma viral a seguir: ORF1ab, na qual o gene da polimerase dependente do RNA (rdrp) está localizado15, e as regiões que codificam N e E.
Começamos por recuperar a sequência do genoma RNA do SRA-CoV-2 a partir do National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank (números de acesso, MN908947, MN908947.3, MN908947.2 e NC_045512.1). Uma análise detalhada de outras sequências publicadas para o genoma SRA-CoV-2 não revelou variações notáveis nestas regiões. Com a ajuda do software de desenho Primer Premier 5.0, desenhámos três sondas para cada uma das três regiões: CoV01 e CoV04, localizadas na região recomendada para a detecção de ORF1ab e N, respectivamente; e CoV08, na mesma região que a E17. As posições genómicas dos locais de ligação das sondas na sequência genómica de referência (NC_045512.2) estão indicadas na Fig. 1f.
O alinhamento da sequência foi realizado entre as sondas e sequências de DNA desenhadas do genoma humano e dos genomas de vírus, bactérias, micoplasma, clamídia e outros patogénios comuns. As sondas corresponderam apenas à sequência genómica da SRA-CoV-2, e não encontramos nenhuma homologia ao ADN genómico humano. Pseudovírus portadores de diferentes regiões do gene alvo construído usando lentivírus como vectores foram usados como controlos positivos. As sequências do gene alvo dos pseudovírus utilizados são mostradas na Tabela Complementar 2. P1 foi positivo para a região SRA-CoV-2 N, P2 para a região SRA-CoV-2 E e P3 para a região ORF1ab do SRA-CoV-2. A concentração dos três controlos positivos foi de 3.000 unidades de transdução (TU) ml-1, indicando que existiam 3.000 partículas de vírus infecciosos por ml. Foram utilizadas como controlos negativos de N1-N17 amostras fisiológicas salinas, água purificada e esfregaços faríngeos positivos para outros patogénios comuns. Uma lista de informações sobre as referências positivas e negativas usadas no estudo é fornecida na Tabela Suplementar 3. Os resultados dos testes são mostrados nas Tabelas Suplementares 4-6. Para a região ORF1ab, as sondas CoV01 e CoV03 foram selecionadas; para a região E, a sonda CoV08 foi selecionada; e para a região N, as sondas CoV04 e CoV06 foram ligadas preferencialmente ao RNA alvo. As sondas de DNA selecionadas foram ainda otimizadas por combinação (Tabela Complementar 7), com cada grupo de sondas visando simultaneamente os três segmentos. Os resultados do teste HC-FIA na Tabela Suplementar 8 mostram que a combinação das sondas Cov01, Cov04 e Cov08 (grupo 2) discriminou entre todas as amostras de controlo positivo e os controlos negativos, e detectou amostras positivas com baixo título viral (1.000 TU ml-1; Tabela Suplementar 3, L1-L3) a uma taxa positiva superior a 95%. O grupo 2 foi, portanto, selecionado como a combinação final. Até à data, existem 13.411 sequências de nucleótidos do SRA-CoV-2 publicadas no NCBI. O alinhamento das três sondas com a região alvo correspondente nas 13.411 sequências carregadas revelou que as regiões alvo das sondas foram conservadas o suficiente para produzir 100% de similaridade.
A optimizámos também as condições de teste do ensaio, em particular o tempo de incubação para a hibridação e o tempo de leitura da tira de teste. O desempenho do ensaio para tempos de incubação de 10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min e 60 min a 56 °C é mostrado na Tabela Suplementar 9. Note que 20 min foram suficientes para as sondas de ADN se hibridizarem com a região alvo, o que foi reflectido pela taxa 100% positiva na detecção de amostras positivas de esfregaço de garganta e esputo com baixo título viral (1.000 TU ml-1; Tabela Suplementar 3, L1-L3). Quando o tempo de incubação foi prolongado para 50 ou 60 min, a reacção não foi tão estável, uma vez que a taxa positiva das amostras de referência L1-L3 diminuiu. Tendo em consideração a eficiência de detecção e a necessidade de inactivação do vírus, seleccionámos 30 min como tempo de incubação para a hibridação a 56 °C. Também avaliamos o tempo de leitura da tira para os valores 10 min, 12 min, 15 min e 18 min (Tabela Suplementar 10). Os resultados indicaram que 12 min ou mais levaram à detecção correcta das amostras de referência positivas e negativas. No entanto, o coeficiente de variação (CV) foi inferior a 10% para a detecção de amostras positivas com baixo título viral apenas quando se utilizou um tempo de leitura de 15 min. Portanto, selecionamos um tempo de leitura de 15 min.
Tiocianato de guanidínio e cloreto de guanidina – os desnaturantes protéicos mais utilizados para extração de ácidos nucléicos – foram comparados como meio de transporte para preservação da amostra. O tiocianato de guanidínio levou a um melhor desempenho na discriminação entre amostras positivas e negativas, com um CV relativamente baixo para amostras com baixo título viral. De fato, o tiocianato de guanidínio em uma concentração tão alta quanto 6 mol l-1 tem mostrado excelentes propriedades antivirais18. Seleccionámos o tiocianato de guanidínio a uma concentração de 5 mol l-1 como desnaturante proteico para inactivação viral em meio de transporte.
Específica do ensaio do HC-FIA
Após optimização das sequências e condições de reacção da sonda, examinámos a especificidade do ensaio do HC-FIA para detecção do SRA-CoV-2. Os controles positivos incluíram pseudovírus (amostras P1-P3) com genes alvo e cinco amostras clínicas de esfregaço de garganta (amostras P4-P8), confirmados com um kit de detecção de ácido nucleico baseado em RT-qPCR (Shanghai ZJ Bio-Tech). Os controlos negativos, que consistiram em amostras de esfregaço de garganta, foram confirmados como negativos para a SRA-CoV-2, e positivos para a gripe A, gripe B, vírus sincicial respiratório, clamídia pneumoniae, adenovírus ou outros agentes patogénicos (amostras N5-N17), ou pseudo-vírus positivos para a região N da MERS (amostra N18) ou SRA (amostra N19). Uma lista de todas as amostras é fornecida na Tabela Suplementar 3. Uma lista dos resultados da detecção de 8 amostras de referência positivas e 15 amostras de referência negativas é fornecida na Tabela Complementar 11.
Nós investigamos se houve reactividade cruzada entre a SRA-CoV-2 e 55 agentes patogénicos comuns que causam doenças respiratórias. A fonte e informação quantitativa de cada microrganismo patogénico é fornecida no conjunto de dados suplementares 1. O título original do vírus foi determinado em 106 unidades formadoras de placas por ml, utilizando um ensaio de placas. Para amostras de interferência de bactérias, micoplasma e clamídia, o nível de concentração foi de 107 unidades formadoras de colónias por ml. Além disso, o DNA genômico humano foi extraído e quantificado para ser 90-105 µg ml-1 a partir de três amostras de sangue inteiro. O ensaio do HC-FIA mostrou uma excelente especificidade para o SRA-CoV-2, sem reactividade cruzada óbvia com todas as outras amostras de agentes patogénicos e DNA genómico humano (conjunto de dados suplementar 1).
Como o anticorpo monoclonal S9.6 também se liga aos duplexes de RNA-RNA19, especialmente os ricos em AU20, desenhámos sequências de RNA de cadeia dupla com fracções variáveis de AU. Informações detalhadas sobre as seqüências são fornecidas na Tabela Complementar 12. Como mostrado na Tabela Complementar 13, independentemente do conteúdo de AU, o ensaio de HC-FIA não apresentou um sinal positivo detectável para RNA de dupla cadeia, o que indica que existe uma baixa afinidade de ligação entre o anticorpo S9.6 e o RNA de dupla cadeia sob as condições do ensaio. Também investigámos se a presença de RNA de dupla corda afecta o desempenho do ensaio na detecção de amostras clínicas de esfregaço de garganta ou expectoração. Utilizámos 2 amostras positivas de esfregaço de garganta, 2 amostras positivas de expectoração, 10 amostras negativas de esfregaço de garganta e 5 amostras negativas de expectoração. Medimos as razões T/C em relação aos valores T/C do teste sem interferências e verificámos que as razões variavam entre 0,9 e 1,1 (conjunto de dados suplementar 1). Isto indica que a presença de RNA de dupla cadeia, independentemente do conteúdo de AU, não afeta significativamente o desempenho do ensaio HC-FIA.
Sensibilidade e precisão do ensaio HC-FIA
Dissolvemos em série as amostras de pseudovírus contendo três seções de genes alvo para títulos de 5.000, 2.500, 1.000, 800, 500, 250 e 100 TU ml-1, e calculamos os valores médios de T/C para 20 testes paralelos. A Figura 2a mostra que os valores limite de detecção (LOD) de pseudo-vírus positivos para as regiões N, E ou ORF1ab do SRA-CoV-2 foram tão baixos quanto 1.000 TU ml-1, com uma taxa positiva superior a 95%. Quando os títulos das amostras de pseudo-vírus atingiram 108 TU ml-1, não se observou efeito de gancho notável (Suplemento Fig. 2). O intervalo linear do ensaio corresponde a títulos entre 103 e 106 ou 107 TU ml-1,
Os eixos verticais mostram a relação de intensidade de fluorescência (T/C) do sinal de teste (T) e o sinal de controle (C). Para cada concentração, foram realizados 20 testes em paralelo. O LOD foi determinado como a concentração na qual a taxa positiva foi maior ou igual a 95%. a, razões T/C para amostras de pseudo-vírus diluídos em série positivas para as regiões N, E e ORF1ab da SRA-CoV-2. b, razões T/C para amostras de esfregaço de garganta diluídas em série de três doentes críticos. Os dados são a média ± s.d.
Amostras de esfregaço de garganta de três doentes críticos – que foram determinadas como positivas para a SRA-CoV-2 usando RT-qPCR, e as cargas virais foram quantificadas usando PCR digital – foram misturadas com amostras de esfregaço de garganta negativas para preparar diluições em série de 2,000, 1,000, 500, 400 e 250 cópias por ml. Como mostrado na Fig. 2b, o LOD foi de 500 cópias por ml com uma taxa positiva de mais de 95%. Amostras de esfregaço clínico de garganta com valores de T/C próximos ao valor crítico (100) para positividade (amostras com 512, 489 e 497 cópias por ml da região ORF1ab, segundo PCR digital) foram utilizadas para verificar o LOD (testes realizados 20 vezes em paralelo). As taxas positivas destas amostras foram superiores a 95% (Tabelas Suplementares 14-16).
Para avaliar a precisão do kit HC-FIA, foram realizados testes paralelos 20 vezes para cada amostra de esfregaço de garganta clínica durante cinco dias consecutivos. As amostras clínicas representativas escolhidas foram uma amostra positiva (1.348 cópias por ml da região ORF1ab), uma amostra de um indivíduo criticamente doente (crítico; 512 cópias por ml) e uma amostra negativa (0 cópias por ml). Os valores médios de T/C dos três lotes na detecção da amostra positiva foram os seguintes: 199,92 ± 8,25 (CV = 4,13%), 200,68 ± 7,91 (CV = 3,94%) e 199,03 ± 7,43 (CV = 3,73%), respectivamente, em comparação com 109,17 ± 5,68 (CV = 4,65%), 110,80 ± 5.63 (CV = 5,08%) e 111,48 ± 4,67 (CV = 4,19%) para a amostra crítica, e com 44,66 ± 3,36 (CV = 7,52%), 43,99 ± 2,72 (CV = 6,18%) e 44,72 ± 2,98 (CV = 6.66%) para a amostra negativa. Os valores de CV lote a lote foram de 3,89%, 4,66% e 6,74%. Assim, o ensaio mostrou boa precisão e reprodutibilidade para a detecção do SRA-CoV-2,
Robustness of the HC-FIA assay
Para aprender sobre a robustez do HC-FIA, avaliamos os efeitos das substâncias de interferência endógena (como a hemoglobina e a mucina) e de substâncias de interferência exógena (em particular, medicamentos clínicos comummente utilizados no tratamento de doentes com infecções respiratórias, incluindo medicamentos antivirais, antibióticos e hormonas). Para esta experiência, utilizámos 18 amostras clínicas de esfregaço de garganta, incluindo seis amostras críticas (500-530 cópias por ml para a região ORF1ab, segundo a PCR digital), seis amostras negativas e seis amostras positivas. Os resultados também foram registrados como a relação dos valores T/C (amostras de interferência versus amostras de controle). Nas amostras de interferência preparadas, as concentrações de hemoglobina foram de 0,5 g l-1, 1,0 g l-1 e 2,0 g l-1, e as concentrações de mucina foram de 5 g l-1, 10 g l-1 e 20 g l-1. As concentrações de drogas de amostras de interferência exógena (Tabelas Suplementares 17-19) foram muito superiores ao seu pico de concentrações de plasma in vivo. Como esperado, todas as razões de T/C estavam na faixa de 0,9-1,1 (Dataset Suplementar 2), indicando que o ensaio de HC-FIA é robusto à interferência.
Avaliação clínica do kit de teste do HC-FIA
Para melhor avaliar o desempenho do ensaio do HC-FIA, um ensaio clínico duplo-cego aleatório foi realizado comparando o ensaio com RT-qPCR (kit de detecção do SRA-CoV-2 produzido pela Shanghai ZJ Bio-Tech, e aprovado pela NMPA) ou com resultados de diagnóstico clínico em três instituições médicas independentes. O kit de teste HC-FIA utilizado na avaliação clínica continha cartões de teste, tampão de lise, solução de preservação de amostras, controlos positivos e negativos e um tubo de reacção com sondas de ADN e anticorpos rotulados. Os resultados do diagnóstico clínico dos casos COVID-19 confirmados ou excluídos, que foram fornecidos pelos hospitais designados, foram baseados em imagens de tomografia computadorizada e nas manifestações clínicas dos pacientes, conforme especificado pelas diretrizes do “Protocolo de Diagnóstico e Tratamento da Pneumonia por Coronavírus Novel (Versão experimental 6.0)” da China. Um total de 734 amostras (593 esfregaços de garganta e 141 expectorações) fornecidas por 670 indivíduos foram testadas em paralelo. Os dados brutos dos ensaios clínicos são fornecidos como Dataset Suplementar 3. O kit de detecção RT-qPCR que utilizámos foi concebido como um sistema de três alvos (ORF, N e E), e seguimos o princípio do teste-reteste para discriminar entre amostras positivas e negativas. Além de quatro testes de falha causados por um padrão interno inválido, foram realizados oito testes: um porque apenas um gene rdrp alvo era positivo, e sete porque apenas os genes N e E eram positivos. Nestes casos, os resultados negativos anteriores foram excluídos.
Dos 670 pacientes inscritos no estudo, 313 eram do sexo masculino (46,72%) e 357 eram do feminino (53,28%). Como mostra a Figura Suplementar 3, a distribuição etária da população inscrita é semelhante à distribuição etária da infecção pelo SRA-CoV-221. A taxa de visitas e a taxa de diagnóstico também foram equilibradas. Os resultados dos kits de teste do HC-FIA são mostrados na Fig. 3, que mostra fotografias de resultados típicos sob uma fonte de luz fluorescente e a matriz de cor gradiente correspondente após a normalização da leitura. A matriz de cores gradientes no Suplemento Fig. 4 mostra as leituras de fluorescência normalizadas de 734 amostras clínicas (Dataset Suplemento 3).
Fotografias de resultados típicos sob uma fonte de luz fluorescente, e as correspondentes leituras fluorescentes como matriz de gradiente de cor, normalizadas para o valor máximo de leitura. O grupo E consiste apenas em resultados COVID-19-negativos. A linha horizontal na barra de cor indica o valor de corte. Uma matriz de gradiente de cor para as leituras de fluorescência de 734 amostras clínicas é fornecida na Fig. 4 suplementar, e os dados numéricos correspondentes no conjunto de dados suplementar 3,
Para 621 casos, os resultados do HC-FIA e os diagnósticos clínicos foram consistentes (210 casos confirmados e 411 casos excluídos; Tabela 1); 49 casos (27 confirmados e 22 excluídos pelo diagnóstico clínico) foram inconsistentes com os resultados do HC-FIA. Para 730 amostras, os resultados do teste HC-FIA foram consistentes com o RT-qPCR (249 positivos e 481 negativos; Tabela 1). Quatro amostras que foram negativas com base no RT-qPCR foram positivas usando o HC-FIA. Três dessas amostras foram de pacientes que foram clinicamente diagnosticados como COVID-19 excluídos, indicando que o teste HC-FIA tinha dado resultados falso-positivos. A amostra restante correspondeu a um caso confirmado pelo diagnóstico clínico, de acordo com o teste HC-FIA.
Cohen’s Kappa (κ), que é uma métrica freqüentemente utilizada da confiabilidade da concordância entre as variáveis categóricas, é uma medida mais robusta em comparação com a simples concordância percentual entre as variáveis, pois κ leva em conta as concordâncias que ocorrem por acaso, especialmente em conjuntos de dados desequilibrados. Consideramos um valor de κ superior a 0,75 para indicar um alto nível de concordância (concordância perfeita corresponde a um κ = 1). Como mostrado na Tabela 2, os resultados do teste HC-FIA estiveram em alta concordância com o diagnóstico clínico (κ = 0,8393) e com RT-qPCR (κ > 0,98, independentemente do tipo de amostra).
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