Métodos, Técnicas e Protocolos de Imunocitoquímica

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Para garantir o livre acesso do anticorpo ao seu antígeno, as células devem ser fixadas e permeabilizadas. Em geral, as forças e tempos de fixação são consideravelmente mais curtos para as células do que nas secções mais espessas e estruturalmente complexas do tecido. Para a imunocitoquímica, a preparação da amostra implica essencialmente a fixação das células alvo à lâmina. A fixação perfeita imobilizaria os antigénios, mantendo a arquitectura celular e subcelular autêntica e permitindo o acesso sem obstáculos dos anticorpos a todas as células e compartimentos subcelulares. Várias faixas de fixadores são comumente usadas, e a escolha correta do método dependerá da natureza do antígeno a ser examinado e das propriedades do anticorpo utilizado. Os métodos de fixação dividem-se geralmente em duas classes: solventes orgânicos e reagentes de reticulação. Solventes orgânicos como álcoois e acetona removem os lípidos e desidratam as células, enquanto precipitam as proteínas na arquitetura celular. Os reagentes de ligação cruzada (como o paraformaldeído) formam pontes intermoleculares, normalmente através de grupos de amino livres, criando assim uma rede de antígenos ligados. Os reticulados preservam melhor a estrutura celular do que os solventes orgânicos, mas podem reduzir a antigenicidade de alguns componentes celulares, e requerem a adição de uma etapa de permeabilização, para permitir o acesso do anticorpo ao espécime. A fixação com ambos os métodos pode desnaturar antígenos proteicos e, por esta razão, anticorpos preparados contra proteínas desnaturadas podem ser mais úteis para a coloração celular. São descritos diferentes métodos de fixação. O método de fixação apropriado deve ser escolhido de acordo com a aplicação relevante.

1. Fixação com acetona

  • Células Fix em acetona a -20ºC durante 5-10 minutos.

  • Não é necessário nenhum passo de permeabilização após a fixação com acetona.

2. Fixação com Metanol

  • Células Fix em metanol a -20ºC durante 5-10 minutos.

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  • Não é necessário nenhum passo de permeabilização após a fixação do metanol.

3. Fixação do Etanol

  • Células de Fix em etanol 95% resfriado, 5% de ácido acético glacial por 5-10 minutos.>

    • Fix em metanol refrigerado, 10 minutos a -20 °C.

    • Remover o excesso de metanol.

    • Permeabilizar com acetona refrigerada durante 1 minuto a -20 °C.

    5. Fixação da mistura de metanol e acetona

    • 1:1 mistura de metanol e acetona.

    • Faça a mistura fresca e fixe as células a -20 C durante 5-10 minutos. Fixação da mistura de metanol e etanol

    6. Fixação da mistura de metanol e etanol

    • 1:1 mistura de metanol e etanol.

    • Faça a mistura fresca e fixe as células a -20 C durante 5-10 minutos.Fixação de formalina

    7. Fixação de formalina

    • Fixar as células em formalina neutra tamponada a 10% durante 5-10 minutos.

    • Lave brevemente com PBS.

    • Permeabilizar com 0,5% de Tritão X-100 durante 10 minutos.

    8. Fixação de Paraformaldeído-Tritão

    • Fixar em paraformaldeído a 3-4% durante 10-20 minutos.

    • Lave brevemente com PBS.

    • Permeabilizar com 0,5% de Tritão X-100 durante 10 minutos.

    9. Paraformaldeído-Metanol Fixação

    • Fixar em paraformaldeído a 4% durante 10-20 minutos.

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      Purificar brevemente com PBS.

    • Permeabilizar com metanol refrigerado durante 5-10 minutos a -20 °C.