Unidade Definição
Uma unidade de atividade de endonuclease de restrição é definida como a quantidade de enzima necessária para produzir um resumo completo de 1 µg de DNA do substrato (ou fragmentos) em um volume total de reação de 50 µl em 60 minutos sob condições ideais de ensaio, conforme indicado para cada endonuclease de restrição.
Determinação do volume de actividade de endonucleases de restrição
Os ensaios de actividade de endonucleases de restrição são realizados adicionando diferentes diluições enzimáticas ao tampão do ensaio apropriado contendo 1 µg de ADN do substrato. Após uma incubação de 60 minutos à temperatura apropriada, a digestão é interrompida e as amostras de ADN são visualizadas por electroforese de gel de agarose/brometo de etídio. A solução enzimática mais diluída que dá uma digestão completa é usada para calcular a actividade em unidades/µl.
Por favor note que a actividade é dependente do substrato e quando se trabalha com um novo substrato, a enzima deve ser titulada para determinar a actividade real ou esperada.
Controles de Qualidade
Os resultados de todos os ensaios de controle de qualidade são relatados na Ficha Técnica fornecida com cada enzima.
Ensaio de Sobredigestão
Um ensaio de sobredigestão foi usado como uma determinação qualitativa da pureza enzimática e da falta de DNases não específicos. No ensaio de sobredigestão, quantidades crescentes de cada endonuclease de restrição (geralmente 10, 20, 30, 40, 50 unidades) são adicionadas a uma série de tubos contendo 1 µg de ADN de substrato. Após uma incubação de 20 horas sob as condições de ensaio recomendadas, o número máximo de unidades que dão um padrão de bandagem claro, nítido e normal é determinado por electroforese de gel de agarose/brometo de etídio.
Para passar no teste, a enzima deve produzir um padrão de bandagem inalterado sob condições de até 600 vezes a sobredigestão (unidades x horas) em comparação com uma digestão de 2 vezes. Se a enzima apresentar actividade “estrela” com um excesso funcional inferior a 600 vezes, a descrição do produto inclui informação sobre o excesso funcional no qual a actividade “estrela” não ocorre.
Ensaio para Endonucleases Não Específicas
Para testar a contaminação por endonucleases não específicas, cada endonuclease de restrição é incubada com um substrato plasmídeo super-revestido sem a sequência de reconhecimento da endonuclease de restrição. Um único nick não específico no DNA RF I converte-o para a forma RF II (círculo de nicked). Quantidades crescentes de enzimas (normalmente 10, 20, 30, 40, 50 unidades) são adicionadas a uma série de tubos contendo 1 µg de ADN RF I (forma super-revestida). Após uma incubação de 20 horas sob as condições de ensaio recomendadas, as duas formas são distinguidas em géis de agarose e a percentagem de conversão de RF I para RF II é determinada.
Ensaio de Ligadura e Recorte
Um ensaio de ligadura foi utilizado para determinar a pureza funcional do ADN após a digestão da enzima de restrição. O ADN do substrato é completamente digerido com um excesso de 10 e 50 vezes da endonuclease de restrição no tampão de ensaio apropriado, ligado com ligase de ADN T4 e recortado com a mesma enzima de restrição. Os DNAs cortados, ligados e recortados são analisados por electroforese de gel de agarose/brometo de etídeo. Um padrão de bandagem normal indica a ausência de nucleases ou fosfatases intactas 5 e 3 terminais, assim como a ausência de nucleases ou fosfatases contaminantes.
Estabilidade
Todas as endonucleases de restrição da Jena Bioscience são reavaliadas a cada 4-6 meses. Este processo permite-nos assegurar uma actividade enzimática completa e um desempenho óptimo em cada enzima que enviamos. Devido aos excelentes resultados deste teste, estendemos as datas de validade da maioria das nossas enzimas para 18 meses.